阿魏酸钠对淀粉样β蛋白片段1-42引起的培养海马神经元损伤的保护作用及机制

闫恩志，范 莹，隋海娟，刘婉珠，金 英

(辽宁医学院1.药理学教研室、2.机能实验中心，辽宁锦州 121001)

阿尔采末病发病机制至今不明，目前也缺乏有效的治疗药物，细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积和细胞内神经纤维缠结是其主要病理改变［1］，此外，在患者脑内也可观察到海马、皮层等部位神经元的功能紊乱和丢失［2］。研究表明Aβ蛋白异常生成和沉积是阿尔采末病发病的关键因素，沉积的Aβ能通过氧化损伤和炎症反应加重患者病情［3］，离体实验也显示Aβ能促使神经元细胞的凋亡和丢失［4］。阿魏酸是中药川芎、当归的有效单体成分，具有抗氧化、抗自由基及抗炎等药理作用，我们研究发现阿魏酸钠能对抗脑室内注射Aβ所致大鼠海马神经元的损伤［5］，能改善老年大鼠的学习记忆障碍［6］，本研究通过原代培养海马神经元细胞方法观察阿魏酸钠对Aβ所致细胞损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 阿魏酸钠(苏州畅通有限公司，纯度大于 99%);Aβ1－42(批号:SCP0038)为 Sigma公司产品;新生胎牛血清、马血清购于广州蕊特生物科技有限公司;DMEM、F12培养基购于Invitrogen公司;胰蛋白酶、L-多聚赖氨酸(Poly-L-lysine)、DMSO均购于Sigma公司;阿糖胞苷购于意大利SPA公司;磷酸化 mTOR(Ser2448)、mTOR、磷酸化 p70S6K(Thr389)、p70S6K均为兔多克隆抗体，购于 Cell Signal公司;抗微管相关蛋白-2(MAP-2)、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗均购自Santa Cruz公司;β-肌动蛋白购于碧云天试剂公司;SuperSignal West Pico化学发光底物购于美国Thermo Scientific公司。其他相关试剂均由辽宁医学院药理实验室提供。

1.2 海马神经元原代培养 取出生24 h内SD乳鼠，辽宁医学院动物实验中心提供，动物合格证号:SCXK(辽)2003－0007。75%乙醇消毒后断头，置于冰上显微镜下分离出海马，剔除血管、脑膜和多余脑组织，预冷的D-hanks液清洗2次，将海马剪成约1 mm3大小的组织小块，加入0.125%的胰蛋白酶，放入CO2孵箱中消化15 min，加入10%马血清培养液终止消化，1 500 r·min－1离心 7 min，弃上清，加入含10%胎牛血清和10%马血清培养液吹打分散细胞，200目钢筛过滤后将细胞悬浮液种植在多聚赖氨酸涂膜的35 mm培养皿或培养板中，48 h后，加入10 μmol·L－1阿糖胞苷，使神经元的纯化率达90%，以后每3 d换液1次。

1.3 细胞分组及药物处理 Aβ1－42临用前无菌生理盐水溶解，溶解后37℃孵育48 h，使其成为聚集状态。选取培养8 d的成熟细胞，实验分为正常对照组:加入0.1%的DMSO 作用72 h;Aβ1－42组:加入终浓度 50 nmol·L－1的 Aβ1－42作用 72 h;Aβ1－42+阿魏酸钠组:先加入不同浓度阿魏酸钠 (50、100、200 μmol·L－1)作用 6 h 后再加入 Aβ1－4250 nmol·L－1作用 72 h。

1.4 MTT法检测神经元活性 将96孔板中的原代培养细胞分组给药处理后，吸弃培养液，每孔加入5 g·L－1MTT 母液 10 μl，用培养基补足至 100 μl，使 MTT 终浓度为 0.5 g·L－1，37℃ 孵育 2 h，吸弃MTT反应液，每孔加入100 μl DMSO，摇床恒温摇动15 min，570 nm波长测定光吸收值，实验结果以细胞存活率表示，细胞存活率/%=(实验组光吸收值－空白对照组光吸收值)/(对照组光吸收值－空白对照组光吸收值)×100%。

1.5 MAP-2免疫荧光染色观察海马神经元树突改变 依据Jin等［7］的方法，培养8 d的海马神经元按分组进行药物处理，观察海马神经元树突的改变。

1.6 Western印迹法检测磷酸化的 mTOR和p70s6K蛋白表达水平 采用35 mm培养皿培养海马神经元，经分组给药处理后，进行磷酸化的 m-TOR、p70s6K蛋白测定，各组细胞进行蛋白定量后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后将凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭，加入一抗后4℃过夜，二抗孵育2 h(1∶1 000稀释)，化学发光凝胶系统分析仪中进行ECL化学发光。利用Visionworks 6.3.3.图像采集及分析软件(UVP LLC，Upland，CA，USA)对蛋白带进行分析。每个实验重复3次。

2 结果

2.1 阿魏酸钠对Aβ1－42引起的海马神经元细胞存活率降低的对抗作用 培养的海马神经元细胞加入Aβ1－42作用72 h后，细胞存活率较对照组明显降低(P＜0.01)，阿魏酸钠 (50、100、200 μmol·L－1)能明显对抗Aβ1－42引起的神经元细胞存活率降低，且呈浓度依赖性(P＜0.01)(Tab 1)。

Tab 1 Effect of SF on cell viability in cultured hippocampal neurons injured by Aβ1－42by MTT assay(±s，n=12)

Tab 1 Effect of SF on cell viability in cultured hippocampal neurons injured by Aβ1－42by MTT assay(±s，n=12)

Primary cultured hippocampal neurons were pretreated with or without sodium ferulate(50，100，200 μmol·L－1)for 6 h，then，aggregated Aβ1－42(50 nmol·L －1)was added to incubate for 72 h.Then neuronal viability was tested by MTT assay.＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Aβ1－42group

Group Dose Cell viability/%Control － 100±7.4 Aβ1－42 50 nmol·L －1 61.5 ±6.1＊＊Aβ1－42+SF 50 nmol·L －1+50 μmol·L－1 88.6 ±5.6##Aβ1－42+SF 50 nmol·L －1+100 μmol·L－1 91.3 ±4.6##Aβ1－42+SF 50 nmol·L －1+200 μmol·L－1 95.6 ±3.7##

2.2 阿魏酸钠对Aβ1－42引起的海马神经元退行性改变的对抗作用 倒置相差显微镜和MAP-2免疫荧光染色结果显示，培养8 d的海马神经元，加入聚集状态 Aβ1－4250 nmol·L－1作用 72 h 后，可使神经元树突出现明显退行性改变特征，表现为树突串珠样改变和树突回缩(Fig 1 A2，B2)，树突总长度和末梢分支数明显减少(Tab 2)。在加入Aβ1－42前6 h，加入阿魏酸钠 (50、100、200 μmol·L－1)可明显对抗Aβ1－42引起的神经元的退行性改变(Fig 1 A3，B3)，表现为神经元树突总长度和末梢分支数较Aβ1－42组明显延长(Tab 2)，树突串珠样改变和树突回缩较Aβ组明显减轻(B3)。

Fig 1 Effect of SF on Aβ1－42induced neuronal degeneration in cultured hippocampal neurons

Tab 2 Effect of SF on Aβ1－42induced dendrite change in cultured hippocampal neurons(±s，n=30)

Tab 2 Effect of SF on Aβ1－42induced dendrite change in cultured hippocampal neurons(±s，n=30)

See Fig 1 for treatment，＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Aβ1－42group

Group Dose Dendrite branch length Terminal branch number Control － 365±97 8.52±2.48 Aβ1－42 50 nmol·L－1 258±74＊＊ 5.69±1.73＊＊Aβ1－42+SF 50 nmol·L －1+50 μmol·L －1 321±56## 6.87 ±2.16##Aβ1－42+SF 50 nmol·L －1+100 μmol·L －1 329±63## 6.96 ±1.85##Aβ1－42+SF 50 nmol·L －1+200 μmol·L －1 358±82## 7.94 ±2.01##

2.3 阿魏酸钠对Aβ1－42引起的海马神经元细胞磷酸化mTOR和p70s6K蛋白表达的影响 培养的海马神经元加入 Aβ1－42作用72 h后，与对照组相比，磷酸化mTOR、p70s6K蛋白表达水平明显降低，总蛋白表达不变。阿魏酸钠(50、100、200 μmol·L－1)可明显对抗Aβ1－42引起的这一蛋白表达的改变 (P＜0.01)(Fig 2，Tab 3)。

Fig 2 Western blot analysis of Aβ1－42-induced change of p-mTOR and p-p70s6K protein level in cultured hippocampal neurons and the inhibitory effect of SF

3 讨论

海马神经元是大脑边缘系统的重要组成部分，具有神经元相对独立分布和高度序化板层结构等特点，主要参与学习记忆、情绪及内脏功能调节，是阿尔采末病等老年性疾病主要病变部位，阿尔采末病患者认知功能损害与大脑皮质和海马神经元大量丢失密切相关［8］。神经突起的数量及长度，是神经元发挥功能的基础，本实验我们发现Aβ能够导致神经元活力下降同时伴有树突明显的退行性改变。Aβ异常的生成和积聚可引发一系列继发病理改变，包括氧化应激、胶质细胞激活及炎症反应，Aβ能够氧化性修饰膜上蛋白和脂质，诱导活化氧自由基产生，活化氧自由基积聚引起细胞膜破坏，透性增加，致使细胞外Ca2+进入细胞内，激活钙依赖性蛋白酶、脂酶激酶，使细胞内自由基生成增多，这些均能损伤细胞器、细胞膜和细胞骨架［9］。

Tab 3 Effect of SF on Aβ1－42-induced change of p-mTOR and p-p70s6K protein levels in cultured hippocampal neurons(±s，n=3)

Tab 3 Effect of SF on Aβ1－42-induced change of p-mTOR and p-p70s6K protein levels in cultured hippocampal neurons(±s，n=3)

See Tab 1 for treatment.Each value was measured by densitometric analysis of Western blot and was expressed by the density ratio of the band to β-actin.＊＊P＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs Aβ1－42

Group Dose Ap-mTOR/Aβ-actin Ap-p70s6K/Aβ-actin Control － 0.489±0.011 0.357 ±0.017 Aβ1－42 50 nmol·L－1 0.157±0.012＊＊ 0.067±0.015＊＊Aβ1 －42+SF 50 nmol·L －1+50 μmol·L －1 0.374±0.012## 0.277±0.013##Aβ1 －42+SF 50 nmol·L －1+100 μmol·L －1 0.448±0.015## 0.317±0.012##Aβ1 －42+SF 50 nmol·L －1+200 μmol·L －1 0.464±0.011## 0.331±0.016##

PI3K/Akt是最重要的促进细胞存活信号传导通路，能促进海马神经元生长和突触分支形成［10］，mTOR是Akt下游的直接作用底物，mTOR激活后可进一步活化其下游的核转录因子p70s6K，mTOR和p70s6K均在神经元树突中表达［11］，有文献表明mTOR/p70s6K也参与海马突触传递增强和记忆形成［12］，我们之前的研究证实激活Akt信号传导通路在上调磷酸化mTOR/p70s6K表达的同时也促进了海马神经元的生长和突触的发育［7］。有研究发现Aβ能抑制海马PI3K/Akt信号传导通路，使磷酸化p70s6K表达降低，损伤海马神经元细胞［13］，我们之前研究也证实大鼠脑室内注射Aβ能抑制磷酸化Akt的表达引起海马神经元损伤［14］，本实验我们通过离体培养海马神经元方法进一步证实Aβ1－42在引起海马神经元树突退行性改变的同时也伴有磷酸化mTOR/p70s6K表达的降低，说明磷酸化 mTOR/p70s6K降低可能是Aβ引起海马神经元损伤及学习记忆障碍的重要机制之一。

阿魏酸属于羟基肉桂酸，毒副作用小，是一种在食物中广泛存的酚类化合物，同时也存在于多种传统中药中，具有抗氧化、抗自由基及抗炎等药理作用。阿魏酸钠作为一种常用的抗氧化剂，能有效的淬灭活化氧自由基，保护细胞膜免受氧化损伤，同时阿魏酸钠也是一种有效的抗炎物质，本实验结果显示阿魏酸钠能有效对抗Aβ1－42所致的原代培养海马神经元细胞的损伤并上调磷酸化mTOR/p70s6K表达，说明阿魏酸钠对Aβ1－42所致的海马神经元损伤的保护作用可能与激活PI3K/Akt/mTOR有关，但其潜在的作用机制还需进一步的深入研究。

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