血中游离DNA与肿瘤

王庆琳，张 荣，肖 莉，4，王伟大，孙爱娟，李 凯，顾振纶

(1.苏州大学药学院分子诊断与生物制药实验室，江苏苏州 215000;2.苏州大学附属第二医院妇产科，江苏苏州 215004;3.苏州中药研究所，江苏 苏州 215000;4.苏州大学附属第二医院分子医学中心，江苏 苏 州 215004)

血中游离DNA简称循环核酸(circulating nucleic acid)，是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。这里，循环核酸非名义上的循环血中的核酸类物质，所有细胞内的核酸，血中游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA与RNA，如真菌血症、细菌血症和病毒血症等病理情况下的血中外源核酸，虽然其在临床医学中具有重要意义但均不属于本文血中游离DNA讨论的范畴。

循环核酸最早由 Mandel和Metais［1］于1947年发现，但由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，导致有关血中游离DNA与疾病相关性的研究在较长时期内进展缓慢。直到有效分离游离DNA技术的出现，特殊荧光染料与PCR技术相结合的检测技术的应用，使这一领域的研究在最近二十多年得到了较迅速发展(Tab 1)。自发现血中游离DNA可含肿瘤细胞DNA相同基因突变后，应用分子生物学手段对循环游离核酸的研究兴趣日益增加，血中游离DNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值。

1 血中游离DNA的来源及性质

血中游离DNA产生的生物学机制较为复杂，除正常细胞的衰老死亡之外，一般认为肿瘤游离DNA主要来源于凋亡与坏死的肿瘤细胞。目前多数研究证明肿瘤组织细胞DNA与游离DNA存在一致的基因改变。肿瘤患者血中游离DNA主要来源于肿瘤细胞坏死凋亡后扩散以及增生活跃肿瘤细胞的释放。对肝癌患者和正常人游离DNA采用1%琼脂糖凝胶电泳时，肝癌患者标本的DNA可表现出较明显的DNA凋亡梯带，可见凋亡细胞可能是游离DNA的重要来源［2］。有报道估计，当直结肠癌患者肿瘤大小为100g时，每天可有高达3.3%即约3 300ng的肿瘤DNA进入外周血中［3］。

血中游离DNA大都以DNA与蛋白质相结合的复合物形式存在，仅少部分为游离DNA片断。健康人血中仅有少量来自坏死或凋亡的衰老细胞DNA，体内自身的平衡机制使健康人的血中游离DNA维持在一个较低水平，正常人外周血中游离DNA含量大部分在100 μg·L－1之下，平均约30 μg·L－1［4］。与正常人相比，肿瘤患者的游离 DNA 浓度增高，这些增加的游离DNA来自肿瘤细胞以及与肿瘤细胞相邻近的非肿瘤细胞，肿瘤患者外周血中游离DNA浓度可高达1 000 μg·L－1，其平均值为 180 μg·L－1［5］。游离 DNA大部分都是双链DNA分子，血中游离DNA片段远小于基因组 DNA，片段长度集中在 0.18 ～ 21 kb 之间［6－7］。Chang等［8］研究表明不同实验组游离DNA水平有统计学差异:肿瘤组122例，非肿瘤组164例，健康对照组44例，测得各组游离DNA水平中位数分别是:肿瘤组59 μg·L－1，非肿瘤组16 μg·L－1，健康对照组7 μg·L－1，表明该论文中的中国肿瘤患者血中游离DNA水平较正常对照有数倍的增加。肿瘤病人血中游离DNA的水平与肿瘤的大小及位置的关系仍有待进一步研究，比较肯定的是在肿瘤发生转移时，血中游离DNA 水平会明显增加［9］。

表1 血中游离DNA临床研究中的里程碑事件［10］

2 血中游离DNA的提取

游离DNA的浓度与多种因素相关，如提取时抗凝剂的使用与否以及所用种类，EDTA抗凝优于肝素或柠檬酸，对涉及到PCR的实验应避免使用肝素。此外，血样存储的温度、血样储存的时间、离心力的大小等因素也能造成血中游离DNA浓度的变化。有文献表明:人血清中的DNA含量可高于血浆3～24倍，血清高于血浆的游离DNA来自于白细胞在体外凝血、纤溶的过程，与病人血中实际的游离DNA数量可能并不相符［10］。

采用不同的提取方法，对游离DNA的浓度有一定的影响。有研究采用传统的酚－氯仿法，硅胶膜吸附柱的商品化提取试剂盒以及磁珠法提取游离DNA，并对3种方法进行比较。研究结果表明，酚－氯仿法的DNA提取效率低，重复性差，不适于微量游离DNA的提取。采用微柱吸附原理的试剂盒简便快速，能有效地除去样本中的各种PCR抑制物，获得较纯的DNA，但是其对小片段DNA提取效率低于磁珠法。磁珠法采用磁珠吸附、磁场分离的原理，操作简便、快速，获得的DNA纯度高，相对丢失率最小，尤其适合于小片段 DNA的提取［11］。

3 血中游离DNA的定性检测

肿瘤发生与原癌基因被激活或抑癌基因受抑制等多种基因突变相关。与肿瘤相关的基因突变包括遗传性和体细胞突变，主要表现为点突变、缺失、插入、DNA重排以及非正常基因融合等。随着分子生物学的发展，以PCR为基础的一系列技术成为检测基因突变简单和有效的手段。在PCR反应的体系中，引物和模板相结合，经过多次循环后，产物将以指数级扩增。按研究对象和目的的不同可采用不同的方法，主要方法简述如下:

(1)PCR-SSCP法:不同序列组成的单链DNA或RNA的空间构象不同，其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时可表现出不同的迁移率，通过与对照核酸进行比较，从而间接反映模板DNA序列间的差异。这类方法主要用于未知突变的筛查。(2)PCR-RFLP法:根据已知突变位点的特征，选择限制性内切酶。通过酶切后的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后的片段长度，可以分析出原DNA突变情况。有实验室用此方法对B3-ARTrp64Arg基因，CYP3A53、CYP3A418B基因的遗传多态性进行分析［12－13］。(3)测序分析:根据目的基因的序列，设计特异性引物，PCR反应的产物经琼脂糖凝胶电泳分离出目的产物，将产物纯化，进行测序分析。测序分析目前仍为突变分析的金标准，既可用于未知突变的筛查，也用于已知突变的确认。(4)特异性引物延伸法:其中高保真聚合酶结合硫化修饰或者荧光标记的分子开关技术通过标记引物3'末端，利用高保真酶的保真性，配对引物得到带标记的产物，而不配对的引物将得不到产物，可以通过产物的有无，判断有无对应的已知突变［14］。

4 血中游离DNA与肿瘤临床

由于血中游离DNA相对无创，简便的样本取材方式以及与肿瘤的相关性使其具有广泛的临床应用前景。血中游离DNA的定性分析，可以对肿瘤进行诊断，血中游离DNA水平的定量分析可以对肿瘤进行分级，确定其肿瘤的发展阶段，制定相应的治疗方案，通过对血中游离DNA水平的检测，可判断患者对放疗的敏感性，以及对肿瘤进行预后包括转移风险的分析［10］。目前临床上除了与肿瘤紧密结合外，逐渐在产前诊断、感染性疾病、免疫性疾病、遗传性疾病中体现血中游离DNA的应用价值。

4.1 癌基因或抑癌基因的突变 外周血中最先检测到的与肿瘤相关的突变基因是Tp53基因和K-ras基因。肿瘤抑制基因p53是人类肿瘤中最常突变的基因，且具有遗传性突变家系的存在。已在结直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤患者游离DNA中检测到p53的点突变［15－17］。Tp53基因突变是肺癌中较为研究深入的肿瘤抑制基因。小细胞肺癌中约90%有Tp53基因的改变，非小细胞肺癌中约50%的Tp53基因突变，最常见的突变形式是C-T的颠换。

K-ras基因是人类肿瘤中常见的原癌基因之一，在人类30%的肿瘤中存在点突变［18］。胰腺癌K-ras基因点突变率平均为80.5%(560/696)［19］，K-ras基因突变与胰腺癌的肿瘤大小、分期及复发率明显相关，并可作为胰腺癌患者的生存分析的独立预后指标。直结肠癌K-ras基因点突变率达40% ～50%以上，且点突变几乎皆位于12、13、61号密码子，其中大多数点突变位于12号密码子［20］。通过血中游离DNA检测到上述相对高发的基因突变，不但可提供早期预警，还在一定程度上为肿瘤的定位诊断提供参考。

4.2 基因甲基化异常 表观遗传学变化是各种恶性病的一种重要的分子改变。而常见的肿瘤相关表观遗传学改变，特别是基因启动子高甲基化，已在肿瘤患者血浆/血清检测中得到证实。Esteller等［21］分析了22例非小细胞肺癌患者肿瘤组织和血清中多个基因启动子高甲基化的发生情况，发现68%(15/22)的肿瘤组织中存在至少一种基因的启动子甲基化，而在正常肺组织中检测结果为阴性。从有关宫颈癌患者血浆DNA的基因启动子甲基化状态的研究中，进一步发现随宫颈癌的临床分期增加和细胞分化不良，血浆中DNA的启动子甲基化检出率逐渐增加。

4.3 微卫星改变 微卫星是基因组中由小于10个碱基组成的DNA串联重复序列，微卫星的改变是肿瘤发生、发展的重要事件，微卫星突变的发生与DNA错配修复系统有关，突变形式包括微卫星不稳定性和杂合性缺失。有研究［22］对21例小细胞肺癌病人的血浆游离DNA和相对应的肿瘤组织DNA中微卫星改变进行了检测并与正常细胞的相同重复序列进行比较。肿瘤组织中检测出微卫星改变为16/21(76%)，血浆游离DNA中检出微卫星改变为15/21(71%)，肿瘤组织和血浆DNA的微卫星改变检出率几乎一致。在非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌等许多肿瘤患者的循环DNA中已检测到了微卫星的改变［23－26］。

4.4 血中游离的线粒体DNA 线粒体DNA为以母系遗传为主的环状核酸分子，在单个细胞中具有数百至数千拷贝，其作为游离于基因组DNA以外的核酸物质，具有较高的突变率。随着对血中游离DNA认识的深入以及血液检测技术的发展，线粒体DNA突变荷载水平与相关肿瘤的临床价值也愈来愈多地被证实。Strelkova IIu等［27］通过对8名肺癌患者以及健康志愿者研究表明，线粒体突变水平与年龄正性相关，而未经化疗的肺癌患者线粒体突变率明显高于正常人对照组，经化疗后，突变线粒体水平增加一倍，可能是由于坏死的肿瘤细胞释放或正常细胞受损所致。Mehra等［28］对75名膀胱癌患者的线粒体进行多变量分析，研究数据提示膀胱癌患者体内的线粒体DNA及RNA荷载水平可作为两年存活率的独立指标之一。血中游离DNA亦或线粒体DNA的荷载水平与肿瘤的相关性已较为确定，对其进行定量分析并检测其是否突变，有助于提高肿瘤的早期诊断水平及预后监控，并可能为研究肿瘤的发病机制提供新思路。

4.5 血中游离DNA与肿瘤转移 近年来，对血中游离的DNA与肿瘤转移的研究结果显示，肿瘤远处转移与血浆DNA水平具有一定的相关性，在血中游离DNA水平较高的患者，发现转移肿瘤病灶的几率同样较高。然而，这一相关性并不能表明其相互的因果关系。为了证实血中游离DNA可以进入细胞内，导致肿瘤的形成，Dolores等［29］使用直结肠癌患者的血浆培养肿瘤易感细胞，得到与血中游离DNA一致的突变型基因的细胞，将含有该基因突变型的细胞植入小鼠体内，一段时间后小鼠体内形成了肿瘤。这一实验不但有力证实了血中游离DNA与肿瘤的转移有密切的联系，还在一定程度上提示，除癌细胞的直接远处转移之外，肿瘤突变基因的远处转移，也可能通过细胞转化而导致继发病的形成。

5 结论与展望

血中游离DNA的检测，在个体化医学中将具有越来越重要的应用价值。随着基因突变致肿瘤的确定以及其在多种其他疾病如自身免疫性疾病和退行性疾病发生发展中作用的认识，用于基因突变检测的标本，已逐步从术后肿瘤组织发展到了痰液、尿液、粪便、胰液和胆汁等多种体液。新近发展起来的外周血游离核酸检测，通过检测血中游离DNA的含量和其完整性，可评价罹患肿瘤的风险，并可能对部分肿瘤作出超早诊断。对确诊的肿瘤患者，血中游离核酸的定量与定性分析，还可用于个体化的治疗方案的确定，以指导临床合理用药，并在一定程度上对预后进行评估。

血中游离DNA的检测，还可对特定热点突变包括甲基化进行针对性分析。这种检测对肿瘤复发的监控，具有较现有肿瘤标志物如肿瘤胚胎抗原(CEA)更高的可靠性［30］。值得指出的是，血中游离核酸检测方法各自的灵敏性相差较大，并且游离DNA检测的特异性尚有待提高。由于血中游离DNA水平的个体差异较大，对其进行定量分析时的动态观察价值尤为明显。目前研究显示血中游离DNA的突变与肿瘤组织具有一致性，利用现有的分子生物学技术，提高血中游离DNA检测的灵敏性及特异性，通过对血中游离DNA更为准确地定性和定量，必将扩大其临床应用尤其是在肿瘤防治中的应用。

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