水杨酸甲酯糖苷抗大鼠急性胸膜炎的作用研究

黄 超，张 丹，辛文妤，李永洁，张天泰，杜冠华

(药物靶点研究与药物筛选北京市重点实验室，北京协和医学院＆中国医学科学院药物研究所，北京 100050)

民族中药滇白珠(学名:Gaultheria leucocarpa var.crenulata)是杜鹃花科白珠树属白果白珠的变种，分布于中国大陆的长江流域以南等地。滇白珠主要用于清热解毒、活血化瘀、祛风除湿、顺气平喘，民间多用于治疗类风湿性关节炎等疾病。水杨酸甲酯糖苷(DL0309)是我们从滇白珠中提取的活性化合物，它具有水杨酸的结构，前期的研究也发现该化合物具有抗炎镇痛作用，其抗炎作用与抑制炎症介质的产生和分泌有关［1－2］。

本研究通过建立角叉菜胶诱导的大鼠胸膜炎模型，考察DL0309是否具有抗大鼠胸膜炎的作用，探讨DL0309抗炎作用与抑制炎症介质及抗氧化作用之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物与试剂 DL0309(由中国医学科学院药物研究所合成，纯度:99%);地塞米松(购自北京市友谊医院);角叉菜胶(购自Sigma，2329535，FC.NO.2829535，lot＆filling code:1408463 50309274［9064－57－7］);BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号:20111018);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号:20111110);大鼠TNF-α酶联免疫试剂盒(购自北京四正柏生物科技有限公司，Lot:20120616)、大鼠IL-1β酶联免疫试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司，Lot:R120615-07a)、大鼠PGE2酶联免疫试剂盒(Catalog No.F16550);水合氯醛(购自国药集团化学试剂有限公司，批号:20100111);

1.1.2动物 Sprague-Dawley(SD)♂大鼠，清洁级，体质量130～160 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号:SCXK(京)2012－0001。

1.1.3仪器 Spectra Max M5(美国 Molecular Devices公司产);离心机(GS-15R离心机，美国 Beckman公司产)。

1.2方法

1.2.1动物分组、造模及给药 取健康♂ SD大鼠48只，按体重随机分为6组，空白对照组、模型对照组、地塞米松组(5 mg·kg－1，ip)、DL0309(150、300、600 mg·kg－1，ig)。造模前 5 d 给药(空白组、模型组给等剂量溶剂，地塞米松组给予等剂量的生理盐水)，造模当天，腹腔注射地塞米松及其他各组给药1 h后，将大鼠用乙醚麻醉，于右胸腔(以动物为视角)第6肋间向内注射10 g·L－1角叉菜胶0.2 ml，空白对照组注射等剂量生理盐水［3－6］。

1.2.2动物处理 造模5 h后，将动物用10%水合氯醛以4 ml·kg－1腹腔注射麻醉，分离腹主动脉，取血(5 000 r·min－1，4 ℃，离心 5 min)，取血浆，－20℃保存。打开胸腔，向胸腔内注入2 ml胸腔洗液(含1%EDTA的生理盐水)，轻柔振荡，收集液体并测量体积;取20 μl胸腔渗出液加入380 μl白细胞稀释液中，混匀后，显微镜下计数。将胸腔渗出液离心，1 200 ×g，4 ℃，离心15 min，取上清，－20℃保存待用。

1.2.3抗炎作用相关指标的测定 收集胸腔渗出液，并测量体积，加细胞稀释液后，对其中的白细胞进行计数［5－7］;该渗出液离心取上清，进行以下指标的测定:BCA法测定蛋白含量，Griess法测定NO含量;ELISA方法测定IL-1β、TNF-α 和 PGE2［8］;取出的血浆，按试剂盒说明，测定 MDA和 SOD含量［9－10］。

1.2.4统计学处理各组数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验进行统计。

2 结果

2.1DL0309对大鼠急性胸膜炎胸腔渗出液体积、白细胞计数的影响角叉菜胶造模5 h后，模型组大鼠胸腔渗出液的体积和白细胞总数均明显高于正常对照组(P＜0.01);阳性对照组(地塞米松)可明显降低胸腔渗出液的体积及白细胞数，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);而DL0309低、中、高治疗组也不同程度地降低了胸腔渗出液的体积和白细胞数目，其中中(P＜0.05)、高(P＜0.01)剂量组与模型组比较差异有显著性。见Fig 1。

2.2DL0309对大鼠急性胸膜炎胸腔渗出液中蛋白质含量及NO含量的影响角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型中，胸腔渗出液中蛋白质和NO含量明显增加，与正常对照组比较，差异具有显著性(P＜0.01);预防给予不同浓度的DL0309均能降低胸腔渗出液中的蛋白含量，其中中剂量组和高剂量组与模型组比较差异有显著性(P＜0.05和P＜0.01);阳性对照药(地塞米松)能明显降低胸腔渗出液中的蛋白含量，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);对于NO含量，阳性药及不同剂量DL0309均能不同程度降低其在胸腔渗出液中的含量，但与模型组比较差异均无统计学意义。结果见Fig 2。

2.3DL0309对大鼠急性胸膜炎胸腔渗出液中炎症因子TNF-α、IL-1β和PGE2的影响与正常组大鼠比较，角叉菜胶诱发的胸膜炎大鼠胸腔渗出液中IL-1β、TNF-α和 PGE2的含量均明显增加;给予不同剂量DL0309的治疗组大鼠胸腔渗出液中IL-1β、TNF-α和PGE2的含量出现不同程度的降低，其中高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。阳性对照药(地塞米松)能明显降低胸腔渗出液中三者的含量，与模型组比较差异有统计学意义。结果见Fig 3。

Fig 1 Effects of DL0309 on exudate volume and total leukocyte number in carrageenan-induced pleurisy model in rats

2.4DL0309对大鼠急性胸膜炎血浆中MDA和SOD的影响模型组大鼠血浆中MDA浓度明显增加，SOD活力值明显降低，给予不同剂量的DL0309后均能不同程度地降低血浆中MDA的浓度，其中中、高剂量组与模型组比较差异有显著性(P＜0.05);同时，DL0309低、中、高剂量均能明显升高血浆中SOD的活力，与模型组比较差异有显著性(P＜0.05)。阳性对照药均能明显降低血浆中MDA的含量和升高SOD的活力(P＜0.01)。结果见Fig 4。

3 讨论

炎症是机体对外来侵入的一种防御性免疫性反应，严重的这种免疫反应会造成机体的损伤。炎症反应是临床常见的病理反应过程，几乎可以发生于机体各部位的组织和器官。角叉菜胶诱导的大鼠急性胸膜炎是一种理想的急性炎症模型，可以定量分析胸腔渗出液体积及其成分、白细胞迁移以及其他炎症相关分子的产生，从而评价急性炎症在动物体内的反应。

Fig 2 Effects of DL0309 on exudate protein concentration and NO level in carrageenan-induced pleurisy model in rats

生理情况下，胸膜腔只有少量的液体，在发生炎症等病理状况下，胸腔膜的渗透性增加，胸腔中大量液体渗出。本实验研究结果表明DL0309能明显抑制液体的外渗以及白细胞的迁移，减少急性胸膜炎大鼠胸腔渗出液的量，同时渗出液中蛋白质的含量也明显降低，渗出液中白细胞数减少，表明DL0309可以有效地抑制角叉菜胶诱发的胸膜炎大鼠中炎性液的外渗以及白细胞的迁移。

PGE2和NO是炎症反应过程中由巨噬细胞释放的重要的炎性介质。PGE2是花生四烯酸代谢途径中COX-2介导产生的重要炎性介质，本研究结果显示DL0309可以降低急性胸膜炎大鼠胸腔液中PGE2的含量，而本课题组的前期研究表明DL0309可以直接抑制COX-2的活性，所以胸腔液中PGE2水平的降低可能与DL0309抑制COX-2的活性有关。

Fig 3 Effects of DL0309 on exudate IL-1β，TNF-α and PGE2 concentration in carrageenan-induced pleurisy model in rats

生理情况下，NO发挥着调控血管扩张和宿主防御的重要作用，炎症刺激时可以导致NO的大量产生，大量由诱导性NO合酶产生的NO是重要的炎症介质，通过产生氧自由基而引起细胞损伤［11］。

Fig 4 Effects of DL0309 on plasma MDA concentration and SOD concentration in carrageenan-induced pleurisy model in rats

IL-1β是一个重要的促炎性细胞因子，有调节免疫和炎症反应的多个方面作用。急性炎症可上调炎症部位IL-1β水平，IL-1β的水平的升高，可引起细胞或组织的损伤［1］。TNF-α(tumor necrosis factorα)是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，T淋巴样细胞系、中性粒细胞等亦可产生。大量产生的TNF-α不仅介导炎症反应，同时还可以进一步诱导巨噬细胞产生IL-1β和IL-6，从而加重局部的炎症反应［12］。DL0309可明显抑制大鼠胸膜炎模型胸腔渗出液中IL-1β的生成和分泌，并抑制TNF-α的产生。

目前认为炎症的发生发展与自由基造成的损伤有密切的关系。因此，抑制自由基的生成可能成为抗炎免疫药物发挥作用的重要机制，抗氧化剂的开发也成为开发此类药物的方向。机体通过酶系统或非酶系统产生氧自由基，它能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化反应，形成过氧化脂质(LPO)，进一步分解为丙二醛(MDA)、酮基、羰基及新的自由基，因此MDA的量通常可以反映机体被脂质过氧化的程度及机体细胞受自由基攻击的程度。超氧化物歧化酶(SOD)是一种源于生命体的活性物质，能消除体内在新陈代谢中产生的有害物质，尤其是对氧自由基，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。在本实验中可以发现，DL0309对大鼠胸膜炎模型血浆中MDA的含量有明显的抑制，除此之外，可以明显增强SOD的活力，两者综合，进一步提示了DL0309发挥抗炎作用可能与抗氧化关系密切。

综上，DL0309可以明显抑制角叉菜胶诱导的急性胸膜炎大鼠胸腔中渗出液的量，同时抑制了白细胞向炎性部位胸腔液的迁移，胸腔液中蛋白的含量也明显降低。DL0309还不同程度地抑制了胸腔液中炎性分子PGE2、NO和自由基、前炎性因子TNF-α和IL-1β等的产生。说明DL0309具有明显的抗角叉菜胶诱导的大鼠急性胸膜炎作用。

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