QuEChERS-HPLC快速测定食品中七种食用合成色素

刘 丽，吴 青，林凤英，邝敏华

（华南农业大学食品学院，广东省食品质量安全重点实验室，广州天河510642）

食用合成色素是以改善食品色泽为目的的重要食品添加剂，在食品加工中被广泛使用。国标GB2760-2011规定食用合成色素的使用范围和使用限量，然而市场上超范围和超量使用食用合成色素的行为有扩展趋势，如在禁止添加色素的肉制品、虾制品、蟹制品中使用，在限制添加色素的豆制品、饮料、糖果、糕点、果冻中超量使用[1-4]。研究报告指出，合成色素的过量摄入会导致人体致泻性、致突性与致癌作用[5-6]。目前国家对食用合成色素的用量作了严格规定[7]并制定了检测方法[8-9]，国标中[8-9]前处理采用聚酰胺吸附法。聚酰胺是具有酸碱二极性的化合物，在酸性条件下与水溶性酸性染料结合，而与天然色素、淀粉等物质分离，然后在碱性条件下解吸食用合成色素。此纯化过程步骤繁琐、操作费时；对于含有大量蛋白质、脂肪等固体样品，按国标方法用水提取时色素提取率低[4]，且在聚酰胺吸附色素后，经G3垂融漏斗抽滤时容易出现堵塞现象[10]；另外，国标方法采用254nm波长检测，食品中许多化学物质在此波长下有吸收，测定时易受样品基质的干扰[11]。QuEChERS作为一种新的前处理方法自2003年诞生以来，主要应用在农药残留检测领域，具有快速、简单、便宜、有效、可靠和安全的特点，其原理是利用吸附剂与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。这一前处理技术目前在食品添加剂检测领域应用较少。本文针对国标方法检测食用合成色素存在的缺陷，首次采用QuEChERS方法[12]结合HPLC，研究肉制品、豆制品中食用合成色素的检测方法，此方法具有更简便的前处理过程、更高的效率，并能满足分析的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、亮蓝、偶氮玉红 购于国家标准物质中心（浓度为0.5mg/mL）；甲醇（色谱纯） （Honeywell）公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（ODS C18） Agela Technologies公司；其他试剂 均为分析纯。

高效液相色谱仪（配有1525泵和2487紫外检测器）、SunFireTMC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm） 美国Waters公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；高速离心机 Eppendorf公司；Milli-Q型超纯水器 美国Millipore公司；WR-2001型溶剂过滤器 上海嘉鹏科技有限公司；UV-3010型紫外可见分光光度计 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 豆制品 将样品搅碎，称取5.0g样品于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入25mL无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1），超声10min，4000r/min离心10min。取上清液12mL置于另一50mL离心管中，加入吸附剂PSA100mg和C18300mg，涡旋2min，4000r/min离心15min，取10mL上清液置于蒸发皿中，用冰乙酸调节至中性，蒸至近干，用水定容至2mL，溶液经0.22μm滤膜过滤后待用。

1.2.1.2 肉制品 将样品搅碎，称取5.0g置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入2g无水硫酸钠，再加入10mL石油醚，充分振荡1min，倒去石油醚，再用石油醚重复两次以除尽油脂。挥干残渣中的石油醚，然后加入25mL无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1），超声10min，4000r/min离心2min，以下步骤同豆制品。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：SunFireTMC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱程序（表1）；流速：1mL/min；柱温：35℃；检测波长：柠檬黄、亮蓝410nm；日落黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、偶氮玉红520nm；进样量：10μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Program of gradient elution

1.2.3 提取和净化条件的优化 通过预实验选取对食用合成色素回收率影响最大的4个因素做正交实验，分别为：吸附剂的种类、含量、超声时间、离心时间。设计正交实验，以食用合成色素回收率为指标，采用L9（34）正交表设计实验，找出最佳提取净化条件，因素水平如表2。

表2 正交实验因素水平表Table 2 Factor and levels table of orthogonal test

1.2.4 方法学考察 在上述优化后的最佳实验条件下进行方法学验证，包括线性关系、方法检出限、最低定量限、加标回收率、精密度。

回收率的计算公式：

式中：Z—回收率（%）；X—样品中的残留量（mg/kg）；M—空白样品中色素测定值（mg/kg）；Y—样品加标量（mg/kg）。

精密度的计算公式：

CV（%）=（SD/X）×100 式（3）

式中：SD—标准偏差（%）；X—样品中色素的平均值；N—测量次数；CV—相对标准偏差（%）。

2 结果与分析

2.1 提取和净化条件的优化

2.1.1 提取液的选择 分别采用水、甲醇∶尿素（1∶1）和乙醇∶氨水∶水（7∶2∶1）对豆制品和肉制品中的食用合成色素进行提取，结果发现，用纯水作提取剂时，样品提取和净化均不充分，各食用合成色素的加标回收率仅为20%左右；用甲醇∶尿素（1∶1）作提取剂时，样品提取液浓缩之后会有大量物质析出难以净化，影响色谱柱的使用寿命，且各食用合成色素的加标回收率为50%～75%；用乙醇-氨水-水作提取剂时，豆制品和肉制品提取液经过吸附剂净化后，回收率高，净化效果好。

2.1.2 净化剂用量对回收率的影响 将一定量的食用合成色素标准溶液加入到乙醇∶氨水∶水（7∶2∶1）中，使浓度达到0.5μg/mL，超声10min后，取5mL混合溶液分别用100、200、300、400mg的PSA和100、200、300、400mg的C18吸附剂净化，调节pH至中性，上机检测。图1A表明，随着PSA用量的增加，对色素的吸附作用有递增趋势，当吸附剂用量为400mg时，色素的回收率为88%左右；图1B表明，C18对7种食用合成色素没有吸附作用。

图1 吸附剂对色素的吸附作用Fig.1 Recoveries of synthetic colorants after absorbed

2.1.3 提取条件和净化剂用量的优化 采用正交实验对豆制品中7种食用合成色素的提取条件和净化剂用量进行优化。设计四因素三水平的正交实验L9（34），以7种食用合成色素的平均回收率为考察指标，结果见表3。

表3 正交实验结果Table 3 Analysis of orthogonal test

由R值大小可知，影响食用合成色素回收率的因素顺序为C（PSA）＞B（离心时间）＞A（超声时间）＞D（C18）。选择各因素最大k值的水平，确定出豆制品最佳的提取和净化条件为A1B3C1D3，即超声10min，离心15min，PSA为100mg，C18为300mg，此时平均回收率为96.98%。

肉制品由于油脂含量比较高，实验发现，超声提取5min后离心，当离心时间超过3min，有油状颗粒悬浮在提取液中，因此选择4000r/min离心2min。

2.2 流动相的选择

采用梯度洗脱，分别比较了甲醇-水、乙腈-10mmol/L乙酸铵以及甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液作流动相对7种食用合成色素分离效果的影响，结果发现，用甲醇-水作流动相时有某些物质峰缺失，不能进行有效洗脱；用乙腈-10mmol/L乙酸铵作流动相时，可实现物质的有效分离，但色谱峰存在拖尾现象；用甲醇-乙酸铵溶液作流动相时，获得的色谱图见图2。从图2可以看出，7种色素分离效果好，各物质峰分离度均大于1.5，且峰型较好；其中亮蓝由于是3种同分异构体的混合物[13]，因而出现三个连续的峰，含量比为3∶21∶76。

图2 7种食用合成色素色谱图Fig.2 Chromatogram of seven synthetic colorants

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系和方法检出限 取空白样品提取液作为7种食用合成色素标准品的稀释液，配制浓度为0.5、1、2、5、10μg/mL的色素工作液，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程和相关系数。取空白鸡肉样品，做3个平行，按上述前处理方法提取、色谱条件进样，得到空白样品色谱图，以信噪比S/N=3计算7种食用合成色素的检出限LOD。从表4可知，除亮蓝因是同分异构体混合物，线性相关系数（0.9971）偏低和检出限（0.3μg/mL）偏高外，其余6种食用合成色素的线性相关系数均达0.9999；柠檬黄、胭脂红和日落黄的LOD为0.1μg/mL，苋菜红、诱惑红和偶氮玉红的LOD为0.2μg/mL。

表4 7种食用合成色素的线性范围、回归方程、相关系数及检出限Table 4 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients and limit of detection of seven synthetic colorants

2.3.2 加标回收率、相对标准偏差及最低定量限（LOQ） 在5.0g空白鸡肉中添加适量7种食用合成色素标准混合液，每个添加量3个平行，进行加标回收率实验，回收率、相对标准偏差和LOQ见图3和表5。结果表明，3份平行样品中，7种食用合成色素的平均回收率均大于80%；相对标准偏差在4.53%～15.23%之间；以信噪比S/N=10计算7种食用合成色素的定量限LOQ，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和偶氮玉红的LOQ为0.3mg/kg，诱惑红和亮蓝的LOQ为0.4mg/kg。

表5 7种食用色素的平均加标回收率、相对标准偏差及LOQTable 5 Recovery、relative standard deviation and the limit of quantification of seven synthetic colorants

图3 7种食用合成色素加标色谱图Fig.3 Chromatogram of seven synthetic colorants with the spiked sample

3 结论

建立了测定肉制品和豆制品中7种食用合成色素（柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝、偶氮玉红、诱惑红）的QuEChERS-HPLC方法，样品前处理简单，处理一个样品需要57min左右，而国标方法则需要75min左右；并且QuEChERS方法还可批量处理样品，节约人力，优势明显；此外，采用可见区波长进行检测，可减少样品中基质的干扰。因此，所建立的方法具有快速、简便、适用于批量处理、实用性强等特点，为监控食品中使用食用合成色素提供了一种快速、方便的方法。

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