王 荣,石冬琴,,谢 华,李文斌,田 薇,贾正平
(1.兰州军区兰州总医院临床药理基地,甘肃兰州 730050;2.浙江农林大学林业与生物技术学院,浙江 临安 311300)
目前,肺癌依然是导致人类癌性死亡的首位疾病,全球每年因肺癌死亡的人数超过100万,其中80% ~90%的患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1]。近年来,虽然肺癌的检测方法学及治疗手段不断改进,但对大多数肺癌患者的预后并没有明显改善,经统计5年生存率仅为10% ~15%[2]。于是,靶向治疗走入人们的视线,通过服用靶向药物来延长患者的生存期。目前,应用EGFR-TKI进行肺癌的靶向治疗相关研究最为广泛。有研究表明EGFR突变在女性、非吸烟者、腺癌这些患者群体中优先出现,而这些特征被证实可以预测吉非替尼在肺癌试验中易瑞沙生存评价[3-4]。本文就EGFR突变及其与临床病理特征、靶向药物治疗及临床意义的相关性进行综述。
1.1 EGFR的生物学特征及其信号转导 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是属于酪氨酸激酶I型受体家族,其家族成员主要包括EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4四种同源受体。基因定位于人第7号染色体的短臂,含有28个外显子。EGFR研究发现广泛分布于各种上皮细胞的细胞膜上,分为胞外区、跨膜区、胞内区三个部分。目前报道EGFR配体有:表皮生长因子 ( EGF)、转化生长因子-(TGF-)、结合肝素的 E GF、双调蛋白、B-cellulin 等[5]。EGFR主要信号转导途径有:RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路、PLC-γ 通路、PI3K-PDK 通路和 J AK-STAT 通路[6]。
1.2 EGFR在NSCLCL中的基因突变 EGFR的基因突变主要发生在胞内TK区域前四个外显子之上(18~21),目前报道发现的TK区域突变有30多种[7](Fig 1)。
主要的突变有[8]:在外显子19处的缺失突变、在密码子719处的点突变(GT19X)、在外显子20处的插入突变、在外显子221-aminosteroid。而在外显子l9处的缺失突变包括从亮氨酸-747到谷氨酸-749,定位于酪氨酸激酶C螺旋区N端,该缺失约占44%。在外显子20处出现的突变约占5%,G719X占4%。在外显子21处的点突变是最常见的EGFRTK区点突变,约占41%。刘红梅等[9]对收集到的31例晚期NSCLC患者的肿瘤组织标本,检测了EGFR酪氨酸激酶域基因突变,其结果表明共检测出12例基因突变,4例为19号染色体缺失突变,其中3例病例为2 235~2 249核苷酸缺失造成E746~A750氨基酸改变,1例病例为2 240~2 257核苷酸缺失,而造成了L747~P753insS氨基酸改变。8例病例为2l号染色体错义突变,均为L858R(T>G)变异,但l8及20号染色体未见突变。Tokumo等[3]报道,在120例外科手术切除的NSCLC样本的18~21外显子检测中发现大多数EGFR突变为19外显子缺失和21外显子的点突变(L858R),这些突变可引起EGFR酪氨酸激酶的活性增强,同时启动不同的信号转导途径。研究表明[10]EGFR在43%~89% 的非小细胞肺癌(NSCLC)中表达为上调,其在肿瘤的形成及其介导瘤细胞的生物行为中发挥着重要的作用,是治疗NSCLC的重要靶点之一,因此,研究 EGFR突变在NSCLC发病中的具体作用机制对EGFR-TKI的治疗、预后及生存期有至关重要的意义。
Fig 1 EGFR mutations in non-small cell lung cancer
目前的研究发现表明[11]EGFR突变与性别、种族、吸烟、病理类型有关,在东方人群、女性、非吸烟、腺癌的患者中变异发生率较高。
Toyooka等[12]研究了311例 NSCLC切除样本,检查其EGFR19和21外显子的突变情况。此外,还对431例NSCLC样本进行了EGFR突变和临床因素(年龄、性别、吸烟状态、组织学、病程和生存情况)的可能相关性进行了研究。进行单变量分析,发现EGFR突变在女性、非吸烟者和腺癌患者的组织中的检出率否认分别要比男性、吸烟者、非腺癌患者的组织中的检出率高。进行多变量分析,发现非吸烟、腺癌组织和EGFR突变存在有重要的联系。这些发现和其他报道相一致,证实同类型人不存在选择差异性。
张静等[13]应用显微切割技术及蝎形探针扩增阻滞突变系统(scorpions amplification refractory mutation system,Scorpions ARMS)检测170例NSCLC石蜡包埋肿瘤组织中EGFR基因第18、19、20和21外显子突变。腺癌、鳞癌和大细胞癌EGFR基因突变的检出率分别为:60.3%(82/136)、0(0/24)和20%(2/0),结果显示:腺癌患者中EGFR基因突变率明显高于鳞癌及大细胞癌患者,腺癌与非腺癌EGFR基因突变比较其差异具有统计学意义(P<0.001);136例腺癌中细支气管肺泡癌(15/22)和其他类型腺癌(67/114)的EGFR基因突变率比较,其差异无统计学意义(P>0.05)。通过比较EGFR基因突变与NSCLC各临床病理特征的关系,表明EGFR基因突变常见于女性、不吸烟、肿瘤较小(≤3 cm)且分化程度较好者(P<0.05),但EGFR基因突变与患者的年龄、淋巴结是否转移及疾病pTNM分期等则无相关性(P>0.05),见 Tab 1。
表1 非小细胞肺癌组织中EGFR基因与临床病理特征的关系
综上所述:EGFR基因突变与性别、种族、吸烟、腺癌、肿瘤大小、分化程度有一定的相关性。因此研究EGFR基因突变与临床病理特征的关系有助于指导临床用药、个体化治疗、手术预后以及延长肺癌患者的生存期。
基于EGFR在肿瘤细胞中的突变,针对EGFR的特异性分子治疗NSCLC靶向药物已被研究并广泛应用于临床。主要靶向药物有两大类:一类是小分子酪氨酸激酶抑制剂(简称TKI),其进入细胞内,并直接作用于EGFR的胞内区,从而干扰三磷酸腺苷(ATP)结合,抑21 bp氨酸激酶磷酸化,代表性的药物如吉非替尼(gefitinib,Iress)和厄洛替尼(erlotinib,Tarcev)。另一类是单克隆抗体(简称单抗),其作用于胞外区,竞争性地抑制配体与EGFR的结合,从而使受体失去活性,影响细胞的生长,代表性的药物如西妥昔单抗(Cetuximab,Erbitux)。
目前许多研究发现EGFR基因突变与小分子酪氨酸激酶抑制剂的疗效相关,其中研究较多的是吉非替尼和厄洛替尼。Tokumo等[3]对21例给予吉非替尼治疗的患者研究发现,携带EGFR突变的肿瘤病人对药物的反应明显较高。日本、韩国、中国台湾、新加坡及中国内地的研究表明[14]使用吉非替尼治疗NSCLC,整体生存率和缓解率东方人群明显优于西方人群,且吉非替尼对以往化疗失败的局部晚期或转移性NSCLC患者疗效和安全性较好。有文献[15-16]报道在NSCLC的EGFR-激酶域突变是激活突变,导致一个基本激活受体,如19外显子的核苷酸2 481到2 495或2 482到2 496位的缺失,外显子21密码子858处的点突变与特异性EGFRTKI的反应有关系,靶向药物吉非替尼和厄洛替尼有明显疗效。另外有研究报道[17]在NSCLC患者中一个异常的EGFR无义突变,临床上反映联合化疗药物厄洛替尼的敏感性低。Lynch 等[18]和 Gazdar等[19]分别报道酪氨酸激酶抑制剂对EGFR发生激活突变的患者疗效明显,且女性、腺癌患者、非吸烟者、亚洲人更容易发生EGFR激活突变。栾焕玲等[20]随机调查了25例服用吉非替尼的患者(Ⅲ期患者5例,其余20例皆为Ⅳ 期,随访时间2009年3月~11月30日),其中15例患者检测出携带EGFR突变,12例患者中8例EGFR蛋白表达阴性,4例蛋白阳性病例(其中3例突变发生在19号外显子),总有效率达到80%;10例未发现EGFR突变的患者为2例,有效率占20%,经比较两者差异有统计学意义(P=0.005)。东方人群的研究显示EGFR突变是一个预测因子因为有利的临床结果,而来自南美和欧洲的研究报道[3,21-29]在 EGFR 突变影响结果和给予 EGFR-TKI治疗的患者临床结果扩增方面存在争议。
综上所述,NSCLC中EGFR突变可以作为EGFR-TKI治疗敏感性的预测因子,可以通过检测EGFR突变的情况来指导临床用药和针对性个体化治疗。所以,为了合理有效的运用靶向药物,如何选择对EGFR相关靶向药物治疗敏感的患者至关重要。
研究结果证实EGFR基因突变与临床病理特征的有一定关系,且深入进行相关靶向治疗的研究,都是以检测EGFR基因突变为基础的。目前临床实践中,EGFR基因突变要在各种临床样本中检测,这些样本包括切除的组织、活组织和胸腔积液中。因此,寻找一种灵敏度高、简单易操作、安全可靠的基因突变检测方法是非常必要的。基因突变检测方法主要是DNA测序、探针扩增阻滞突变系统(ARMS)、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、突变体富集PCR(mutant-enriched PCR)、毛细管电泳-激光诱导荧光检测法(CE-LIF)。
DNA测序法[30]是检测EGFR基因突变标准可靠的、应用最多的方法。该方法首先对样品进行PCR扩增然后对扩增产品纯化,最后进行序列分析,操作过程步骤繁琐、时间较长,且对操作技术的要求较高,重要的是由于其方法本身的灵敏度低,仅能检测含量大于30%的突变基因。从环境经济方面考虑,此方法在临床应用中存在局限性,不适合大量临床样品分析。
探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异PCR,是将ARMS和Scorpions技术相结合的一种新技术。目前已有检测EGFR突变的试剂盒,由英国的Delivering Pharmacogenomics公司推出。张静等[13]应用此试剂盒对EGFR的18~21外显子进行检测,检测结束后定量PCR仪以扩增曲线的形式输出结果,根据DxS EGFR检测试剂盒使用说明书判读原则进行突变结果判读,170例NSCLC标本EGFR突变的总检出率为49.4%(84/170)。Kimura 等[31-32]分别采用 Scorpions ARMS 和测序法检测了患者血清中EGFR的两个热点突变情况,结果表明Scorpions ARMS的检出率明显高于测序法(分别是48%和38%)。但该方法仅为少数研究机构应用,尚未批准进入临床。
聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)与直接测序法相比,该法灵敏度高,可以发现测序未能发现的基因突变,然而也有其局限性:耗时长、操作复杂,不能定量只能定性分析。
突变体富集PCR(mutant-enriched PCR)既是PCR-酶切法,与直接测序法比较,敏感性较高,因为经过两次PCR扩增,EGFR激活突变(包括外显子19缺失和外显子21点突变)的检测率高、特异性强,可从103~104个野生型拷贝中检测到一个EGFR突变基因[33]。但只能对已知的突变位点设计特异性引物进行测序,因此有一定的局限性。
对上述方法进行分析比较,发现DNA测序法是目前检测基因突变的可靠标准。一项研究表明:通过EGFR基因拷贝数扩增预测EGFR-TKI疗效的原因在于实验所选择患者中包含了大量的EGFR突变患者。EGFR突变是主要原因,而EGFR基因拷贝数扩增是关联因素,进行EGFR-TKI疗效预测可通过检测EGFR突变为主[34]。因此,目前寻找一种快速准确的EGFR基因突变检测方法是亟需解决的问题。陈巧云等[35]采用 CE-RFLP方法快速、高效地完成了胃癌p53基因248位、249位密码子突变情况的同时检测。刘圆圆等[36]还将此方法应用于临床59例胃癌患者肿瘤组织H-ras基因12位密码子点突变情况的检测,获得了较好的效果。因此,对于EGFR基因突变也可以采用高效毛细管电泳方法来检测。EGRF基因突变的检测对早期诊断、筛查EGFR-TKI敏感人群、预后治疗、延长生存期、避免不必要的毒副作用及防止肿瘤多重耐药性的发生等有无可替代的意义。
表皮生长因子受体(EGFR)属于酪氨酸激酶I型受体家族成员,在大多数非小细胞癌(NSCLC)中表达上调,是治疗NSCLC的一个重要靶点。EGFR基因突变与临床病理特征相关,不同的人群,EGFR基因突变及突变率不同,靶向治疗前针对患者的病理特征进行分析有助于指导临床医生用药。靶向药物因特异性强、毒性低成为目前临床靶向治疗用药的一个研究热点。EGFR基因突变在NSCLC中较常见,且与EGFR的特异性分子靶向药物的治疗效果密切相关。已有研究证实EGFR基因突变检测与NSCLC靶向治疗相关,使用EGFR-TKI前应检测EGFR突变。所以寻找一种快速准确能应用于临床大量样本检测的EGFR基因突变检测方法是当务之急。通过检测相关突变基因来指导临床用药同时为不具备基因靶点病人节省费用和毒副作用,减少了患者经济、心理负担,将会是分子靶向治疗的一个热点及发展趋势。
[1]Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.CA:a cancer journal of clinicians[J].Cancer Stat,2007,57(1):43-66.
[2]Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2006 [J].CA Cancer J Clin,2006,56:106-130
[3]Tokumo M,Toyooka S,Kiura K,et al.The relationship between epidermal growth factor receptor mutations and clinicopathologic features in non-small cell lung cancers[J].Clin Cancer Res,2005,11:1167-73.
[4]Mitsudomi T,Kosaka T,Endoh H,et al.Mutation the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small cell lung cancer with postoperative recurrence[J].Clin Oncol,2005,23:2513-20.
[5]韩 雪,戴广海.胃癌中EGFR相关研究及意义[J].临床肿瘤学杂志,2010,15(2):173-6.
[5]Han X,Dai G H.Research on EGFR in gastric cancer and its significance[J].Chin Clin Oncol,2010,15(2):173-6.
[6]Cao C,Lu S,Sowa A,et al.Priming with EGFR tyrosine kinase inhibitor and EGF sensitizes ovarian cancer cells to respond to chemotherapeutical drugs[J].Cancer Lett,2008,266(2):249-62.
[7]Sharma S V,Bell D W,Settleman J,et al.Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer[J].Nat Rev Cancer,2007,7(3):169-81.
[8]Fukui T,Mitsudomi T.Mutations in the epidermal growth fact or receptor gene and effects of EGFR tyrosine kinase inhibitors on lung cancers[J].Gen Thorae Cardiovasc Surg,2008,56(3):97-103.
[9]刘红梅.表皮生长因子受体基因突变与晚期非小细胞肺癌的分子靶向治疗[J].南方医科大学学报,2009,29(11):2273-5.
[9]Liu H M.Epidermal growth factor receptor gene mutations with advanced non-small cell lung cancer molecular targeted therapy[J].J Southern Med Univ,2009,29(11):2273-5.
[10]Scag liotti G V,Selvagg I G,Novello S,et al.The biology of epidermal growth factor receptor in lung cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10:4227-32.
[11]Paez J G,Janne P A,Lee J C,et al.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefltinib therapy[J].Cancer,2004,304(5676):1497-500.
[12]Toyooka S,Soh J,Shigematsu H,et al.The impact and role of EGFR gene mutation non-small cell lung cancer[J].Cancer Chemother Pharmacol,2006:58(1):25-31.
[13]张 静,梁智勇,高 洁,等.非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因及k-ras基因突变与临床病理特征的关系[J].协和医学杂志,2010,1(1):53-9.
[13]Zhang J,Liang Z Y,Gao J,et al.Relationship between the mutations of epidermal growth factor receptor gene and k-ras Gene and the clinicopathological features of non-small cell lung cancers[J].Med J Peking Union Med Coll Hosp,2010,1(1):53-9.
[14]Sanford M,Scott L J.Gefitinib:a review of its use in the treatment of locaHy advanced/metastatic non-small cell lung cancer[J].Drugs,2009,69:2303-28.
[15]Sharna S V,Bell D W,Settleman J,et al.Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer[J].Nat Rev Cancer,2007,7:169-81.
[16]Irmer D,Funk J O,Blaukat A .EGFR kinase domain mutationsfuctional impact and releva16-18 Human Chromosomes for lung cancer therapy[J].Oncogene,2007,26:5693-701.
[17]González Manzano R,Martínez Navarro E,Eugenieva E,et al.A novel EGFR nonsense mutation in a non-small-cell lung cancer(NSCLC)patient who did not derive any clinical benefit with combination chemotherapy and erlotinib[J].Clin Transl Oncol,2008,10:442-4.
[18]Lynch T J,Bell D W,Sordella R,et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor under lying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J].NEJM,2004,350(21):2129-39.
[19]Gazdar A F.Activating and resistance mutations of EGFR18 Chang’non-small-cell lung cancer:role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors[J].Oncogene,2009,28:S24-S31.
[20]栾焕玲,孙蕾娜,董 娜,等.非小细胞肺癌中EGFR和K-ras基因突变与蛋白表达相关的研究[J].中国癌症杂志,2010,20(7):486-91.
[20]Luan H L,Sun L N,Dong N,et al.Study of the correlation of EGFR and K-ras gene mutations with its protein expression in nonsmall cell lung cancer[J].China Oncol,2010,20(7):486-91.
[21]Bell D W,Lynch T J,Haserlat S M,et al.Epidermal growth factor receptor mutations and gene amplification in non-small-cell lung cancer:molecular analysis of the IDEAL/INTACT gefitinib trials[J].Clin Oncol,2005,23:8081-92.
[22]Cappuzzo F,Hirsch F R,Rossi E,et al.Epidermal growth factor receptor gene and proteinand gefiinib sensitivity in non-small-cell lung cancer[J].Natl Cancer Inst,2005,97:643-55.
[23]Chou T Y,Chiu C H,Li L H,et al.Mutation in the tyrosine kinase domain of epidermal growth factor receptor is a predictive and prognostic factor for gefitinib treatment in patients with non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2005,11:3750-7.
[24]Han S W,Kim T Y,Hwang P G,et al.Predictive and prognostic impact of epidermal growth factor receptor mutation in non-small cell lung cancer patients treated with gefitinib[J].Clin Oncol,2005,23:2493-501.
[25]Mitsudomi T,Kosaka T,Endoh H,et al.Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence[J].Clin Oncol,2005,23:2513-20.
[26]Riely G J,Pao W,Pham D,et al.Clinical course of patients with non-small cell lung cancer and epidermal growth factor receptor exon 19 and exon 21 mutation streated with gefitinib or erlotinib[J].Clin Cancer Res,2006,12(31):839.
[27]Shih J Y,Gow C H,Yang P C.EGFR mutation conferring primary resistance to gefitinib in non-small-cell lung cancer[N].Engl J Med,2005,353:207-8.
[28]Takano T,Ohe Y,Sakamoto H,et al.Epidermal growth factor receptor gene mutations and increased copy numbers predict gefitinib sensitivity in patients with recurrent non-small-cell lung cancer[J].Clin Oncol,2005,23:6829-37.
[29]Tsao M S,Sakurada A,Cutz J C,et al.Erlotinib in lung cancermolecular and clinical predictors of outcome[N].Engl J Med,2005,353:133-44.
[30]Fan X,Furnari F B,Cavenee W K,et al.Non-isotop silver-stained SSCP is more sensitive than automated direct sequencing for the detection of PTEN mutations in a mixture of DNA extracted from normal and tumor cells[J].Int J Oncol,2001,18(5):1023-6.
[31]Kimura H,Kasahara K,Kawaishi M,et al.Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as apredictor of the response to gefitinib in patients with non-small cell lung cancer[J].Cancer Res,2006,12(13):3915-21.
[32]Kimura H,Suminoe M,Kasahara K,et al.Evaluation of epidermal growth factor receptor mutation status in serum DNA as a predictor of response to gefitinib(IRESSA)[J].Br J Cancer,2007,97(6):778-84.
[33]Asano H,Toyooka S,Tokumo M,et al.Detection of EGFR gene mutation in lung cancer by mutant-enriched polymer as chain reaction assay[J].Clin Cancer Res,2006,12(1):43-8.
[34]郭爱林.IPASS临床研究公布不同EGFR分子标记物改变对临床疗效的影响[J].循证医学,2009,9(4):200.
[34]Guo A L.IPASS clinical study published the different EGFR molecular markers change clinical efficacy[J].J Evidence-Based Med,2009,9(4):200.
[35]陈巧云,王 荣,贾正平 等.毛细管电泳-限制性片段长度多态性快速检测胃癌组织中p53基因点突变的方法[J].分析化学,2007,9:1305-8.
[35]Chen Q Y,Wang R,Jia Z P,et al.Fast detection of p53 gene mutation of gastric cancer by restriction fragment length polymorphism with capillary electrophoresis[J].Chin J Analyt Chem,2007,35(9):1305-8.
[36]刘圆圆,王 荣,贾正平,等.毛细管电泳-限制性片段长度多态性分析检测胃癌H-ras基因点突变[J].化学学报,2009,67(4):323-8.
[36]Liu Y Y,Wang R,Jia Z P,et al.H-ras gene mutation detection of gastric cancer by restriction fragment length polymorphism with capillary electrophoresis[J].Acta Chim Sin,2009,67(4):323-8.