计数观察 鱼软骨多糖对小鼠黑色素瘤中血管生成拟态的时空变化及对CD31的影响

孟 康，郭 斌，王 冠

(1.辽宁医学院药学院，辽宁 锦 州 121001;2.辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

以往的研究对血管生成拟态(VM)随时间和空间变化规律有了一定的认识［1－2］，但对它与内皮依赖性血管之间的关系和二者的演变过程没有进行深入细致的研究，尤其是在加入魟鱼软骨多糖(RCG)的条件下，对VM的研究少之又少。目前，我国在魟鱼生理活性物质的研究方面取得了一定进展，从魟鱼软骨中提取、分离出具有抗肿瘤活性成分。本实验通过建立C57小鼠黑色素瘤模型，观察RCG对黑色素移植瘤的时空变化的影响及影响其变化的细胞因子CD31的表达情况，发现RCG可抑制B16黑色素瘤的血管生成，且可能通过降低肿瘤细胞分泌细胞因子来抑制肿瘤细胞对血管内皮细胞增殖和迁移的促进作用，从而达到抑制肿瘤新生血管形成的作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组及给药方法 清洁级C57BL/6小鼠(18～22)g，♂，60只，随机分为5组:生理盐水组(saline)、RCG 高剂量组(RCGH，900 mg·kg－1)、RCG 中剂量组(RCGM，300 mg·kg－1)、RCG 低剂量组(RCGL，100 mg·kg－1)、环磷酰胺(CTX)组(60 mg·kg－1)。黑色素瘤细胞株B16用RPMI 1640细胞培养基传代培养。对每只小鼠右腋下注射0.2 ml的细胞悬液。各组接种后d 2开始ip给药，CTX组每周1次，其它各组每日1次。根据随机数字表，每天抽取1只小鼠处死，共持续12 d。解剖并仔细检查动物全身，获得肿瘤样本。

1.2 免疫组织化学染色和CD31、PAS双重染色 全部样本均经体积分数为0.10福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片。免疫组织化学染色和CD31、PAS双重染色进行观察，免疫组织化学染色操作步骤按SP法进行。

1.3 统计学方法 首先利用计算机图像处理软件计算每张切片中坏死面积，在进行中央区与外周区的划分时，避开肿瘤坏死，将每张切片中肿瘤组织平均分为3部分，占肿瘤组织内约1/3部分为中央区，外1/3的部分即为外周区，其余为中间区域。把VM、内皮依赖性血管为核心的高倍视野划分为VM、内皮依赖性血管附近，即中央区;距离中央区一个高倍视野的肿瘤细胞即距离VM和内皮依赖性血管较远的部分为外周区。VM判断标准:管腔内存在红细胞，周围没有出血坏死和炎症细胞浸润，且无内皮细胞衬复的PAS阳性管道、衬复PAS阳性物质的肿瘤细胞围成不规则管腔。数据以中位数的形式表示，应用SPSS 19.0统计软件包对该实验资料进行数据处理。

2 结果

2.1 实验现象 肿瘤直径2～10 mm，有淡黑色，表面有丰富的血管，与周围的非肿瘤组织分界不清，切开面呈现红黑色，呈浸润生长，实性、质地有弹性和光泽。染色后可见VM、内皮依赖性血管等血液供应方式共存现象，部分区域散在出血坏死。通过观察CD31和PAS双重染色，在该移植瘤的第1周内可见到肿瘤间质中樱桃红色的PAS阳性血管样图案，VM已形成，1周后逐渐被内皮依赖性血管所替代。

2.2 RCG对VM时空变化的影响 通过观察VM和内皮依赖性血管的情况，VM密度在肿瘤中央区随时间变化呈现先增加后递减趋势，并且RCG剂量越大，同一时刻下的血管生成密度越小。中央区的VM较多，周边区较少，RCG影响中央区比周边区要明显。内皮依赖性血管的密度变化体现了同样的变化特征。内皮依赖性血管密度在肿瘤中央区和外周区均呈现递减趋势，随着RCG试剂组浓度的增高，同一时刻下内皮依赖性血管的密度逐渐降低。

2.3 RCG对CD31在肿瘤不同区域的表达的影响 与生理盐水组比较，随着RCG各剂量组浓度的增高，VM中央区和外周区的肿瘤细胞CD31的表达逐渐降低，见Tab 1，同样内皮依赖性血管在肿瘤的中央区和外周区均呈现递减趋势。见Tab 2。因为统计所有数据均为非正态分布，故实验中所有数据均用中位数表示。

Tab 1 Vasculogenic mimicry CD31 expression in different regions

Tab 2 Endothelium dependent period of CD31 expression in different regions

2.4 相关性分析 通过SPSS 19.0分析，在肿瘤数为20的条件下，不同浓度RCG对CD31、VM密度的表达之间存在相关性，Tab 3可得RCG与CD31、VM密度之间存在密切的负相关性。对其具有一定的抑制作用。

Tab 3 RCG and CD31 correlation analysis，RCG and angiogenesis mimicry density correlation analysis

3 讨论

观察RCG对黑色素移植瘤的时空变化的影响及影响其变化的细胞因子CD31的表达情况，研究显示RCG可抑制B16黑色素瘤的血管生成。结果表明在不同浓度(900、300、100 mg·kg－1)的RCG下，CD31、内皮依赖性血管的浓度和VM的密度呈线性降低(P＜0.05)。并观察到表达CD31的肿瘤细胞在间质中彼此黏附，具有连接形成管腔的趋势，同时发现一部分衬复在PAS阳性物质内壁的肿瘤细胞分泌CD31抗原作为一个细胞间的连接分子，使肿瘤细胞在变形后能模仿内皮细胞更好地连接在一起，形成血液通道。国际上通过生物试剂研制抗癌新药的趋势正在兴起［3］，对于RCG的研究并不多见，深入研究RCG是必要的［4］。以上实验结果提示我们，RCG对于肿瘤的治疗可能具有一定的应用价值，值得进一步研究。

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