替加氟衍生物M1的合成及其体内外抗肿瘤活性研究

秦三海，刘爱芹，于胜海，王风玲

(山东省医学科学院药物研究所，山东省罕少见病重点实验室，山东 济南 250062)

化疗是治疗癌症的重要手段之一，替加氟为常用的一线化疗药物，但其不良反应严重，如何使其在发挥抗肿瘤作用的同时，减少毒副作用成为众多学者关注的焦点。本研究以替加氟为母体，分子中引入1，3，4-噻二唑类杂环和酰氨基团，设计合成新型化合物 M 1，使其抗肿瘤活性叠加，毒性降低，并对其体内外抗肿瘤活性进行了研究，以期为合成高效低毒的抗肿瘤药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、动物、药品试剂及仪器 人胃癌细胞株HGC27、人肝癌细胞株SMMC7721和人结肠癌细胞株HCT15(购自中国科学院上海生命科学研究所);小鼠肉瘤S180(引自中国医学科学院药物研究所);昆明种小鼠(山东鲁抗医药股份有限公司动物中心);氢氧化钠(上海华美医用精细化工厂，分析纯);盐酸(宜昌市银海化学试剂厂，分析纯);甲酸(天津市大茂化学试剂厂，分析纯);二氧六环(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯);氨水、二甲基甲酰胺、硫代氨基脲(国药集团化学试剂有限公司，化学纯)。RPMI 1640(美国Gibco公司);MTT(美国 Sigma公司);红外光谱仪(Nicolet Nexus 670 FT-IR型傅立叶变换红外光谱仪，固体KBr压片);核磁共振波谱仪(Bruker Avance 600、Inova-500);元素分析仪(Perkin-Elmer PE2400);质谱仪(Trap VL);水套式二氧化碳培养箱(美国Forma公司);多标记检测仪(美国PerkinElmer公司);倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)。

1.2 M1 的合成

1.2.1 1-(四氢-2-呋喃基)-3-乙酸基-5-氟-2，4-嘧啶二酮的制备［1］称取3-(甲氧基羰基甲基)替加氟6.8 g于250 ml三颈圆底烧瓶中，加35 ml甲醇，加热使其溶解，滴加10 mol·L－1NaOH溶液，于50℃水浴中反应4 h，减压蒸除溶剂，加入50 ml蒸馏水及50 ml乙酸乙酯，有机层用50 ml水萃取1次，合并水层，然后用1.2 mol·L－1HCl调pH 4，再用乙酸乙酯萃取(50 ml×2)，合并有机层，加入无水硫酸钠10 g干燥0.5 h，过滤，蒸除溶剂，得白色固体4.7 g，收率为73.4%。

1.2.2 2-氨基-1，3，4-噻二唑的制备 于 250 ml三颈圆底烧瓶中，加入甲酸2.14 ml和硫代氨基脲3.65 g，搅拌下滴加14.6 mol·L－1磷酸11 ml，在85 ℃水浴中加热8 h，将反应液倾倒入冰水中，并用浓氨水调至pH 9，析出白色沉淀，减压抽滤，粗品在水中重结晶，得白色结晶2.8 g，收率为69.3%。

1.2.3 1-(四氢-2-呋喃基)-3-乙酰氨基-(1，3，4-噻二唑-2-基)-5-氟-2，4-嘧啶二酮(M1)的制备 将2.58 g 1-(四氢-2-呋喃基)-3-乙酸基-5-氟-2，4-嘧啶二酮、1.26 g 2-氨基-1，3，4-噻二唑加至500 ml三颈瓶中，加入200 ml二甲基甲酰胺，搅拌使其溶解，置冰浴条件下搅拌降温，缓慢滴加含2.06 g DCC的二甲基甲酰胺溶液100 ml。在此温度下搅拌3 h，室温下继续搅拌8 h，减压抽滤。将滤液置于1 000 ml分液漏斗中，加入300 ml乙酸乙酯及300 ml蒸馏水萃取，弃去水层，乙酸乙酯层用20 g无水硫酸钠干燥0.5 h，过滤，将滤液浓缩至原体积的一半，室温放置，长形白色针状DCC聚合物结晶析出后，过滤，滤液放置48 h，析出白色结晶M1，重结晶得纯品0.71 g，收率为20.8%。

1.3 抗肿瘤活性试验

1.3.1 MTT法观察M1对肿瘤细胞的细胞毒作用 取接种培养24 h的肿瘤细胞，分别加入浓度梯度为100.00、20.00、4.00、0.80 和 0.16 mg·L－1的 M1，同时设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组(CDDP)，每组设3个平行孔，药物作用48 h后，于535 nm处测定各孔吸光度(OD)值，计算平均OD值，采用LOGIT法求IC50值并绘制细胞生长曲线。

1.3.2 M1对小鼠移植瘤S180的实验治疗作用 分别取18～22 g健康小鼠60只，于右侧腋窝皮下接种小鼠肿瘤细胞悬液0.2 ml(5×106个)，接种次日按体重随机分5组，分别为阴性对照组、阳性对照组、M1高、中、低剂量组，阴性对照组鼠数20只，其余各组10只。M1使用时用NS配成含1%DMSO的无菌混悬液，现用现配。高、中、低剂量组给药剂量分别为 50、25、12.5 mg·kg－1，阳性对照组给药氟尿苷，给药剂量为50 mg·kg－1，阴性对照组给予等容积溶媒。腹腔注射给药，每日1次，给药体积每只0.5 ml，连续给药10 d，末次给药24 h后，处死动物，解剖瘤块称重，计算肿瘤生长抑瘤率。

2 结果

2.1 M1结构鉴定 经 IR、MS、元素分析、1HNMR结构表征，合成的化合物与设计的目标化合物结构一致。化合物的IR、MS、元素分析与1HNMR 数据如下:IR(KBr，cm－1):3480(νN-H)，2895(νCH2)，1680(νC=O)，1574(νC=C);ESI-MS(m/z)正离子检测:341.9［M+H］+，363.9［M+Na］+;元素分析C:42.03%，H:3.57%，F:5.33%，N:20.65%，O:18.91%，S:9.51%(理论值 C:42.23%，H:3.54%，F:5.57% ，N:20.52%，O:18.75%，S:9.39%);1H-NMR(600 MHZ，DMSO-d6)δ，ppm:1.92 ～2.05(3 H，m)，2.24 ～2.30(1 H，m)，3.81 ～3.85(1 H，m)，4.26 ～4.30(1 H，m)，4.71～4.80(2 H，m)，5.95～5.97(1 H，s)，8.08～8.09(1 H，s)，9.20(1 H，s)，12.99(1 H，s)。

2.2 M1对肿瘤细胞的抑制作用 随着药物浓度的增加，HGC27、SMMC7721和HCT15等3种人癌细胞株细胞存活率逐渐降低，以100 mg·L－1作用最为明显，分别为18.21%、22.29%、20.15%，且在0.16-100 mg·L－1浓度范围内对细胞的抑制作用呈剂量依赖性，但细胞生长抑制率均未超过50%。

2.3 M1对小鼠移植瘤S180的实验治疗作用 化合物M1对荷肉瘤S180小鼠肿瘤生长具有一定的抑制作用，给药剂量50、25 mg·kg－1对小鼠肿瘤生长抑制率为分别50.28%、46.41%，同时药物治疗组的小鼠生活状况较好，精神正常、饮食正常、活动自如、皮毛光滑，体重有不同程度增加，在本试验有效剂量范围内，无明显毒性，试验过程中动物健康、无死亡;阳性对照组小鼠干瘦，精神呈萎靡状态，饮食欠佳，皮毛稀疏、干燥、粗乱、蓬松，体重明显降低。见Tab 1。

3 讨论

据文献报道噻二唑类衍生物具有抗细菌、抗病毒、抗惊挛、抗真菌等生物活性［2－3］，多数酰胺类化合物具有药理活性，又易于与有机体形成氢键，也可能改变药效，化合物M1是以替加氟为母体设计合成的新型化合物，分子中引入1，3，4-噻二唑类杂环和酰氨基团，可使其抗肿瘤活性叠加，毒性降低，生物利用度提高。

Tab 1Therapeutical effect of M1 on S180bearing mice(±s)

Tab 1Therapeutical effect of M1 on S180bearing mice(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs the negative group

group Dose/mg·kg－1Tumor weight/g Tumor inhibitory rate/%Negative － 1.81 ±0.77 －Positive 50 0.79 ±0.26＊＊ 56.35 M1 50 0.90 ±0.34＊＊ 50.28 25 0.97 ±0.39＊＊ 46.41 12.5 1.36 ±0.44 24.86

本方法工艺条件温和，操作简便。合成中间体时，为了降低成本，加入过量的甲酸;合成目标物时，采用缩合剂DCC及催化剂DMAP，经多次试验发现DMAP的催化作用并不明显，最后仅采用DCC。滤液浓缩体积至一半，有助于物质的洗出，因杂质与产物溶解度不同，DCC产生的聚合物首先析出，然后是目标物，最后母液含有其他杂质。避免了柱层析分离的繁琐及节省了洗脱剂，目标物纯度达99%以上。

M1体外对HGC27、SMMC7721和HCT15等3种人癌细胞株细胞具有一定的抑制作用，在0.16～100 mg·L－1浓度范围内对细胞的抑制作用呈剂量依赖性，但细胞生长抑制率均未超过50%，表明药物体外无明显细胞毒作用，但体内抑瘤试验结果表明药物50、25 mg·kg－1剂量组对小鼠肿瘤生长抑制率均＞40%，具有体内抑瘤活性［4］，究其原因为M1在体外只是前体化合物，脂溶性高，须在体内转化为5-Fu而起抗肿瘤作用。

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