冠心病患者血清中HB-EGF、TGF-β1的表达*

刘一剑 谭祖松 邓晋 黄珲 冯宏达 谢哲 游咏

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一组因冠状动脉粥样硬化致使血管腔狭窄、阻塞或功能性改变如冠脉痉挛导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病变，是动脉粥样病变中最常见的类型，也是严重危害人类健康的常见病。其病理改变在本质上是动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）。然而AS的发病机制至今尚未明确。近年来，国外相关研究显示，HBEGF在肺组织、骨骼肌组织、脑组织、心肌组织、脂肪组织等多个组织中表达，尤其在脂肪组织中高表达，具有广泛的生物学活性，然国内对该研究仍不多。TGF-β1参与冠状动脉粥样硬化的形成和狭窄、心肌梗死后重塑、细胞凋亡等过程，是冠心病领域研究的热点，但在冠心病过程中的作用尚未完全阐明，仍有争议[1-3]。本实验通过RT-PCR技术分析HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA在冠心病患者血清中的表达情况，进一步分析两者在动脉粥样硬化发生、发展中的作用，希望能为冠心病从分子基因水平的防治提供新思路、新途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取南华大学第一附属医院2012年-2013年住院病例，入院诊断考虑冠心病并通过冠状动脉造影确诊患者60例，其中ACS组30例、SAP组30例，并选取同期经详细询问病史、体格检查及胸片、心电图、血、尿、大便常规、血生化检查均未见异常及选择性冠脉造影（CAG）无血管病变者出院修正诊断为健康人或心脏神经官能症20例作为对照组（NC组）。所有入组病例均排除严重肝肾脑肺疾病、严重瓣膜性心脏病、心肌病、风心病、肺源性心脏病患者、重症感染、甲亢、活动性结核、近1个月内应用激素或其他免疫抑制剂、肿瘤、自身免疫疾病、感染性疾病或感染急性期、银屑病、妊娠、近期皮肤及组织损伤等病患。

1.2 试剂 血液RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、2×Taq MasterMix逆转录试剂盒、100bp Ladder Marker试剂盒（上述试剂均购自北京康为世纪生物公司）；PCR引物及PCR反应体系mix由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 CHD诊断标准 按2007年美国心脏病学会（American College of Cardiology，ACC）/美国心脏协会（American Heart Association，AHA）冠心病指南的诊断标准。

1.3.2 基本指标的测量 身高及体重测量：要求选用同一身高体重计测量，所有对象均应于清晨空腹状态下，穿单衣单裤、赤脚，脚跟、骶骨部及两肩胛间紧靠身高计立柱上。连续测两次取其平均值。计算体重指数（BMI 体重公斤数除以身高米数平方）。血压测量：所有对象均应于清晨醒后、空腹未服用药物、情绪平稳、未运动状态下测量，连续3 d清晨测量2次，取平均值；测量方法：选用汞柱式血压计，根据柯氏音第一音及消失音时水银柱凸面相应垂直高度纪录相应收缩压及舒张压，取平均动脉压（MAP），平均动脉压=（收缩压+2×舒张压）/3。

1.3.3 血脂测定 所有患者均于入院后第1天清晨空腹采外周静脉血，测定其甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白胆（LDL），所有标本使用德国罗氏全自动生化仪测定。

1.3.4 外周血提取RNA 所有患者均取自于外周动脉血（用柠檬酸盐、EDTA或肝素等抗凝剂处理过的血液样品），所取标本按购买试剂盒说明书严格执行RNA提取，提取过程中保持无菌原则，取1 μL RNA经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。并予紫外分光光度计准确定量，要求OD260/OD280于1.8～2.2之间。

1.3.5 RNA逆转录成cDNA 提取RNA后立即行逆转录，按逆转录试剂盒说明书严格执行，所得逆转录产物保存于-20 ℃冰箱。

1.3.6 RT-PCR 收集所有标本后进行RT-PCR。PCR总反应体系为20 μL，其中逆转录产物2 μL、Mix 10 μL、各基因上、下游引物分别1 μL、RNase-Free Water 6 μL。HBEGF反应参数：94 ℃变性5 min后进行30个循环，循环条件：94 ℃ 30 s，49 ℃ 40s，72 ℃ 40 s；最后 72 ℃终延伸 2 min。TGF-β1反应参数：94 ℃变性5 min后进行30个循环，循环条件：94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，最后 72 ℃终延伸2 min。内参β-actin反应参数：94℃变性4 min后进行26个循环，循环条件：94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物直接用于下列电泳或4 ℃保存。PCR仪（型号：德国biometra T-Gradient），见表1。

表1 PCR引物序列

1.3.7 PCR产物琼脂糖凝胶电泳及结果分析 配制1.5%琼脂糖凝胶，取PCR目的基因产物及β-actin各3 μL点样后进行电脉，设置恒压为90 V，约30 min后结束电泳，用凝胶成像分析系统（型号：美国alpha3400）观察结果，拍照后测定DNA扩增带光密度值，取目的基因光密度值与相应β-actin光密度值之比作为统计参数。

1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料用（±s）表示，实验组与对照组间检验其正态性方差齐性，各组之间采用两独立样本t检验、单因素方差分析，并采用Pearson相关分析、Spearman等级相关法对其他可能相关因素进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHD组与NC组比较 CHD组患者中HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA明显高于对照组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.2 ACS组与SAP组各项指标比较 ACS组患者中HBEGF mRNA及TGF-β1mRNA明显高于SAP组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表3及图1-2。

2.3 HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA在血清中表达与血压、血脂的相关性 结果示体重指数、平均动脉压、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白与HB-EGF mRNA表达无明显相关性，亦与TGF-β1mRNA表达无明显相关性，见表4。

3 讨论

HB-EGF是表皮生长因子家族成员之一，是多种类型细胞有丝分裂原，亦涉及许多生理和病理过程，包括心脏发育及心肌修复、心肌肥大、皮肤伤口愈合、眼睑形成、肾集合管生成、胚泡着床、肺动脉高压、肿瘤形成等。HB-EGF在动脉粥样硬化、平滑肌细胞增生中有重要作用。研究表明，HB-EGF与胞膜上表皮生长因子受体（EGFR）、硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）紧密结合，通过蛋白激酶C和Ca2+等信号途径发挥作用，促进平滑肌细胞、上皮细胞、系膜细胞、纤维细胞等多种细胞增生[4]。Kishida K等[5]人研究发现，在AS斑块组织中，HB-EGF在VSMC和巨噬细胞的表达显著提高，促进动脉硬化，而在非AS成人动脉中，内膜平滑肌细胞HB-EGF呈均匀分布，且随着年龄的增加而缓慢增加。Reape等[6]在AS斑块组织HB-EGF的表达和定位的研究中发现，对比正常和AS的血管壁，HB-EGF mRNA只在AS组织和用其培养的VSMC中表达，在巨噬细胞中高表达。本实验最后结果证实，在冠心病患者血清中，HB-EGF在基因转录水平较正常对常组明显增高。还发现HB-EGF的信号通道比较复杂，近年来HB-EGF与肿瘤和心血管疾病的发生机制的研究日趋活跃，通过对信号通道的研究有望开发出以HB-EGF为靶向因子的新型药物治疗方式。最新的两项关于动脉粥样硬化免疫组化的临床研究均发现[7-8]，HB-EGF

在斑块局部呈阳性表达，证实HB-EGF能刺激平滑肌细胞细胞的增殖，迁移，从而在动脉粥样硬化形成的过程中发挥作用。这与本文的研究结果一致。因此，笔者可以推断在动脉粥样硬化斑块的发展过程中，HB-EGF可作为动脉粥样硬化治疗的一个新的靶点。

表2 CHD组与NC组各项指标比较

续表2

表3 ACS组与SAP组各项指标比较

续表3

图1 ACS、SAP、NC血清中HB-EGF mRNA表达情况

图2 TGF-β1 mRNA表达情况

表4 HB-EGF mRNA及TGF-β1 mRNA在血清中表达与血压、血脂及两者之间的相关性分析

TGF-β1是TGF-β超家族成员之一，其参与冠状动脉粥样硬化的形成和狭窄、心肌梗死后重塑、细胞凋亡等过程，是冠心病领域研究的热点，但在冠心病过程中的作用尚未完全阐明且有较多争议。Argmann等[9]在小鼠动脉粥样硬化模型中发现，TGF-β1可以抑制巨噬细胞LDL残体或氧化的极低LDL残体，减少高密度脂蛋白（HDL）与巨噬细胞和泡沫细胞的结合。Kenny等[10]在反复阻塞和再灌注发作时冠状动脉内注射TGF-β1，明确发现可以诱导血管壁细胞的分化，促进微血管成熟和血管新生。Tashiro等[11]研究证实低水平的TGF-β1可促进PDGF-α的表达，介导平滑肌细胞的迁移和增殖；当其水平较高时，平滑肌细胞表面的PDGF受体α亚单位的表达受抑制，抑制平滑肌细胞的增殖；其不仅能调节平滑肌细胞的迁移与增殖，而且能调节平滑肌细胞表型的转变，对动脉脉粥样硬化起到保护作用。本研究最后结果进一步映证，冠心病患者血清中TGF-β1表达明显较对照组明显降低，提示高水平的TGF-β1对冠心病患者可有一定保护作用。

不稳定性粥样斑块破裂或脱落并继发性出血栓形成是急性冠脉综合征的重要病理基础，不稳定性斑块所占比例越高，发生ACS可能越大。不稳定斑块多为薄而偏心性纤维帽，内含有大片脂质坏死中心并有大量炎性细胞浸润，细胞外基质及平滑肌细胞很少。而纤维帽厚，脂质坏死中心小，基质及平滑肌细胞多而炎性细胞少的斑块强度大，不易破裂，发生ACS事件偏少。Ross[12]教授提出“AS是一种炎症性疾病”学说，指出AS是具有慢性炎症反应特征的病理过程，其发展始终伴随炎症反应。研究表明，TGF-β1可在体内发挥强大的非特异性抗炎作用[13-14]。本研究结果提示在ACS组患者中，其TGF-β1表达较SAP组患者明显偏低，提示TGF-β1可能参与AS炎症过程，进一步印证Ross教授的“AS是一种炎症性疾病”学说。

综上所述，HB-EGF在冠心病患者中明显增高，其可能作为其发生、发展过程中独立危险因素而存在。而TGF-β1则可能AS发生、发展过程发挥独特抗炎作用。本研究结果提示，血脂及血糖与HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA并无明显相关联系。因入院前患者有部分服用降脂药物及饮食中糖及脂含量未做进一步统计分析，仍须在临床工作中进一步分析观察。同时对其相关机制仍须进一步研究探讨。

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