木薯粉与甘蔗糖蜜混合发酵高浓度酒精

申乃坤，王青艳，秦 艳，朱 婧，王成华，廖思明，黄日波

(广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室国家非粮生物质能源工程技术研究中心;广西生物炼制重点实验室，南宁530007)

木薯、甘蔗等作为非粮作物因糖类含量丰富，成为可用于燃料乙醇生产的候选原料［1］。但是以木薯粉原料进行浓醪发酵时，存在固形物浓度增大，流动性差的缺点，容易发生沉淀，不利于大罐连续发酵，也不利于蒸馏时醪塔塔釜的再沸器间接加热，其废糟由于含有COD浓度太高而不好处理［2］。而糖蜜中含有5% ～12%的胶体物质，是由果胶质、焦糖和黑色素等组成，这是酒精发酵时产生大量泡沫的主要原因，因而降低发酵罐的利用率;胶体物质在酒精发酵时会吸附在酵母的表面，使酵母新陈代谢作用发生困难，特别是焦糖与黑色素对酵母的酒精发酵作用抑制较大。此外，糖蜜中还含有大量灰分和一些重金属离子(Cu2+、Pb2+等)，都不利于糖蜜高浓度发酵［3］。

现有技术中用于酒精和燃料乙醇生产的原料，基本上都是以单一原料为主，而且生产燃料乙醇存在技术水平低(醪液酒精终浓度10% ～12%，V/V)，发酵效率低(85% ～88%)，能耗大，环境负荷大及经济性有待进一步提高等问题。在高浓度酒精发酵技术研究上，国内外有关的科研机构已开展了相应的工作，通过选育高产菌株及发酵条件优化，其发酵菌株酒精发酵浓度最高可达16% ～18%(V/V)［4-7］，但其发酵时间较长，发酵效率低，同时其发酵底物大多为玉米淀粉或甘蔗汁等单一原料［8-9］。有关混合原料发酵酒精研究较少，申乃坤［10］等对木薯粉与甘蔗汁混合原料发酵酒精的工艺进行了研究;陈勇等［11］对木薯粉甘蔗汁混合发酵申请了相关专利。而以木薯粉与糖蜜原料采用同步糖化(SSF)混合发酵生产高浓度燃料酒精的研究还未见报道。

本文采用木薯粉与糖蜜原料混合发酵燃料酒精，既提高了发酵醪液的总糖浓度，又降低了淀粉质原料醪液的固形物浓度，改善流动性，同时也可以减弱糖蜜中有害成分对酵母菌的毒害作用，缩短发酵时间，提高了发酵醪液的酒精浓度，从而提高原料的转化速率和利用率，降低酒精的原料成本。从而节约了蒸馏蒸汽用量，又减少单位吨酒精的排糟量，而且废糟更容易处理，减少废糟的处理负荷，使酒精生产过程更环保。

1 材料与方法

1.1 实验材料

木薯粉 本地产木薯干片，总糖(以葡萄糖计)含量71.56%。

甘蔗糖蜜 广西丰浩酒精有限公司提供，锤度为83.5°Bx，总糖(以葡萄糖计)49.5%。

耐高温淀粉酶及糖化酶购自诺维信公司［10］。

1.2 试验菌株

酵母菌种为酿酒酵母GXASY-10。

1.3 培养基

种子培养基(YPD):葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨2%。

发酵培养基制备［12］:采用同步糖化发酵(SSF)，取不同浓度的木薯粉放入250 mL三角瓶中，加自来水调浆，加入适量耐高温α-淀粉酶，在震荡水浴锅85℃液化40 min，降温到32℃，冷却调pH值，加入适量糖化酶添加量为1.21 AGU/g木薯粉，并添加0.2%尿素、0.1%K2HPO4、0.05%MgSO4，接种发酵。糖蜜原料可在不同阶段加入，若在液化后加入，需要用稀硫酸调糖蜜的pH值至3.8～4.0以抑制杂菌生长。

1.4 测定方法

酒精测定:气相色谱法［13］。

还原糖测定［14］:DNS(3，5-二硝基水杨酸)比色法。

总糖测定［15］:采用稀硫酸调节 pH值至1.0，沸水浴水解1 h后，测定所含还原糖量即为总糖含量。

2 结果与分析

2.1 木薯粉与糖蜜的比例对混合原料高浓度酒精发酵的影响

根据前期试验结果，将总糖浓度定为26%，木薯粉和糖蜜以不同的比例混合(W/W)调浆后，制备发酵培养基，并添加适量的氮源、无机盐及糖化酶，接种(10%，V/V)发酵，发酵条件为:发酵温度32℃、转速100 r/min，发酵周期48 h，发酵结束后测定醪液的残糖和酒精浓度。每个条件设置3个平行，结果取平均值，以下同。

图1 混合原料比例对酒精发酵的影响Fig 1 Effect of the mixing ratio on ethanol fermentation

从图1可以看出，木薯粉与糖蜜的比例直接决定着发酵醪液的粘度和有害物质(焦糖、黑色素、重金属离子等)的浓度，当木薯粉与糖蜜比例大于2：1时，发酵醪的木薯粉浓度过高，导致醪液的粘度及渗透压过大，酵母菌生长和发育受到抑制，同时发酵过程中放出的二氧化碳逃逸受到抑制，从而减缓发酵速度，发酵速度延长，影响原料和发酵设备的利用率;当木薯粉与糖蜜比例小于2：1时，发酵醪的糖蜜浓度过高，糖蜜中的有害物质会影响酵母菌生长和代谢［13］，从而降低酒精生产。因此，木薯粉与糖蜜浓度的合适比例为2：1，此时酒精浓度最高为13.58%(V/V)。

2.2 糖蜜添加时间对混合原料高浓度酒精发酵的影响

糖蜜添加时间主要体现在发酵醪液糖浓度变化，若糖蜜添加过早，醪液的糖浓度过高，抑制酵母菌的生长发酵;若添加过晚，酵母菌的活力下降，糖代谢速度减缓，影响糖的利用。为了考察糖蜜添加时间对发酵的影响，分别在0、6、12、18、24 h 添加糖蜜，发酵结束后测定醪液的残糖和酒精浓度，结果见图2。

图2 糖蜜添加时间对酒精发酵的影响Fig 2 Effect of the add sugarcane molasses time on ethanol fermentation

从图2可知，在0 h、6 h添加糖蜜时，酵母菌还处于延滞期，耗糖速度较慢，而培养基中木薯粉在糖化酶作用下不断释放出葡萄糖，使发酵醪液中糖浓度过高，影响酵母菌生长和发酵，发酵时间延长;而18 h、24 h添加糖蜜时，随着发酵进行，醪液酒精浓度升高，酵母菌活力下降，耗糖速度变慢，进而残糖偏高、酒度下降。因此，糖蜜在发酵12 h时添加为宜。

2.3 混合原料高浓度酒精发酵的重要影响因素筛选

影响混合原料酒精发酵的因素很多，除了总糖浓度和糖蜜添加时间外，还包括发酵初始pH值、氮源、无机盐、接种量、发酵条件等，用常规方法很难快速找出影响发酵的主要因素。而P-B(Plackett-Burman)试验可以从众多的考察因素中高效筛选出最为重要的因素［16］，所以本实验采用此方法进行重要因素的筛选。根据单因素实验及前期研究结果［10，12］，对发酵总糖浓度，糖蜜添加时间、初始pH值等9个因素进行考察，以醪液酒精体积浓度(%，V/V)的平均值Y为响应值，每个因素取2个水平，试验选用实验次数N-11的设计，并余留2个空白项估计实验误差。P-B实验设计及结果见表1，实验设计因素及水平见表2，实验结果统计分析采用Design-expert7.1.6软件，从t检验结果可知，有3个因素影响的可信度大于90%，分别是发酵总糖浓度X2＞糖蜜添加时间X1＞发酵的初始pH值X5，说明这3个因素是对发酵结果影响较大。需要对这3个较重要的因素进行进一步优化。

2.4 最陡爬坡试验设计

根据P-B试验筛选对发酵有显著影响的因素及水平，设计最陡爬坡试验，找到进一步响应面优化的中心点。试验设计及结果如表3所示。

表1 P-B试验设计及响应值Table 1 P-B experiment design and its response

表2 各因素及水平对P-B实验结果的影响Table 2 The effect of factors，levels on results of P-B experiment design

表3 最陡爬坡试验结果Table 3 The result of steepest ascent experimental

由试验结果可知，酒精浓度最高出现在第3次附近，酒精浓度为15.59%(V/V)，说明最陡爬坡试验的最优点在试验3附近，故以此点为响应面实验因素水平的中心点。

2.5 响应面(RSM)实验设计

响应面法是通过近似构造一个具有明确表达形式的多项式来表达隐式功能函数。它可以对P-B试验筛选出的关键因子和最陡爬坡设计确定的浓度进一步优化，已获得满足发酵目的最优培养基。响应面设计采用Box-Behnken［17］法，以P-B试验确定重要因素及最陡爬坡试验得到的中心点各取3水平进行试验设计如表4所示。根据Design-expert7.1.6试验软件设计了3因素3水平共15个实验点进行响应面分析(表5)。

表4 Box-Behnken试验因素及水平Table 4 Factors and levers of Box-Behnken experiment

表5 Box-Bohnkon试验设计与结果Table 5 Experimental design of Box-Bohnkon and corresponding results

以酒精产率Y值为响应值，对表5结果进行数据回归分析，试验因子对Y的影响可得到方程:

回归方程的方差分析表明，交互项的影响不明显，试验因子与响应值之间不是线性关系，而一次项和二次项对响应值的影响是十分显著的。对Box-Behnken实验结果进行方差分析(见表6)。

表6 Box-Bohnkon试验方差分析Table 6 Analysis of variance of Box-Bohnkon experiment

一般认为相关系数R2大于0.9，表明预测值能与试验值具有高度相关度［18］，而本试验中R2=0.9587，说明方程的拟合度很好，真实试验点结果可以用该回归方程进行分析，仅有不到5%的产量变化不能利用该模型解释。“Model Prob＞F”等于0.0058远小于0.05，说明模型是重要的。图形更能形象的反应响应值受各个影响因素的变化，通过得到的多元回归方程做响应曲面图(见图3～5)。

由图3～5可知，X1，X2，X3存在极值点，Y 的最大估计值为16.03，此点3个影响因子的代码是 X1=0.57、X2=0.25、X3=0.41，即总糖浓度为 29.14%，糖蜜的添加时间为16.5 h，发酵初始pH值为4.7，此点醪液预测的酒精浓度最高为16.03%。

2.6 验证实验

为检验此模型对试验结果预测的准确性，在筛选出最优条件下对最佳点进行3次1 L发酵罐验证试验，发酵过程酒精浓度及残还原糖变化见图6(结果取平均值)。发酵结果平均值为16.07%。表明验证实验结果与模型预测值非常接近，说明该模型比较真实地反映各筛选因素对混合原料酒精发酵的影响。

图6 1 L发酵罐发酵结果Fig 6 The fermentation result of 1 L fermentor

3 结论

本文先采用P-B试验筛选出影响木薯粉与甘蔗糖蜜原料混合发酵的主要影响因素，然后利用最陡爬坡试验初步确定各因素的最优点作为响应面试验的中心点，最后利用Box-Behnken设计确定筛选出因素的最佳水平。筛选出的最佳条件为:混合原料的总糖浓度为29.14%，糖蜜的添加时间为16.5 h，初始发酵pH值为4.7。在技术集成的基础上，进行了3次1L发酵罐放大实验，发酵成熟醪平均酒精浓度为16.07%(V/V)。这表明采用木薯粉与甘蔗糖蜜混合原料发酵酒精，既提高了发酵醪液的总糖浓度，又降低了淀粉质原料醪液的固形物浓度，改善流动性，同时也可以减弱糖蜜中有害成分对酵母菌的毒害作用，缩短发酵时间，提高了发酵醪液的酒精浓度，从而提高原料的转化速率和利用率，降低酒精的原料成本。

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