无血清培养基的成分改进及应用现状

杨颜慈，郭 斌，殷 红

(西部资源与现代生物技术省部共建教育部实验室陕西省生物技术重点实验室西北大学生命科学学院，西安710069)

动物细胞培养技术是当今生物工程领域中的前沿研究课题之一，培养动物细胞可以分离和鉴定病毒、进行遗传、代谢及发育调节方面的研究，并可利用基因工程技术生产与人类健康和生存密切相关的生物制品，如疫苗、基因重组蛋白质、抗体药物、基因治疗药物等［1］。通常，动物细胞的培养有赖于血清的存在，在传统的天然培养基和合成培养基中，如果不加血清，绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清又存在着道德和科学上的问题［2］，如对实验动物的伤害、存在潜在的污染源、不同批次血清间的生物活性和因子的不一致及价格高等诸多弊端。在2003年4月5日至7日，Vera Baumans和Jan van der Valk组织召开了一场专题讨论会议，主题是“改进体外培养技术方法，减少胎牛血清在细胞、组织培养上的应用”［2］。2009年在哥本哈根一场类似的专题会议召开，会议讨论了可以提高无血清培养基(SFM)发展及利用的策略［3］。有大量实践证明无血清培养基不仅能在很大程度上避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷，而且也能取得良好的培养效果。因此，无血清培养基得到了越来越广泛的应用。

1 无血清培养基的发展过程

从1975年垂体细胞株 Gh3在无血清介质中生长获得成功到现在，无血清培养基的发展大致经历了3代［4］，即第一代一般意义上的无血清培养基，第二代无血清无动物衍生蛋白培养基，第三代双无培养基。随着科技的进步，第四代无血清培养基的研究开发并投入市场将成为发展趋势。其各自的成分、优缺点及应用见表 1［4-7］。

表1 无血清培养基的发展过程Table 1 The development process of serum-free medium

2 无血清培养基成分的改进

无血清培养基的成分十分复杂，一般认为其由两部分组成，即基础培养基和补充因子。基础培养基是各种营养物质的混合物，是维持组织或细胞生长、发育、遗传、繁殖等一系列生命活动必不可少的物质。目前应用最广泛的是 MEM、DMEM、RPMI1640等。补充因子是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称。这些补充因子可使培养基既能满足动物细胞培养的要求，又能有效避免和消除含血清培养基的成分不明确、有批次间差异、常被病毒和支原体污染、血清来源不稳定、细胞产品不易纯化等问题。补充因子可分为必需补充因子和特殊补充因子［7］。胰岛素、转铁蛋白和硒几乎是所有的细胞株在无血清培养基中生长时都需要的，即为必需补充因子［8］。特殊补充因子可分为:激素和生长因子、结合蛋白、贴壁和铺展因子、微量元素和低分子量营养因子、酶抑制剂等［8］。

由于无血清培养基的成分相对比较清楚，所以人们可因培养目的及细胞种类，选择合适的基础培养基或改变补充因子的种类及用量以达到更好地培养目的。主要在以下几方面进行了改进。1)调整补充因子中生长因子的种类及用量。Kumiko Iwata等［9］研发出一种适合于软骨细胞快速生长的无血清培养基，其培养基成分是:生长因子 FGF-2(100 ng/mL)、insulin(5 μg/mL)、EGF(10 pg/mL)、PDGF(625 pg/mL)、TGF-β(5 pg/mL)以及生物材料白蛋白、透明质酸酶。他们用该培养基培养软骨细胞10 d后，软骨细胞的数量大约增长了25倍，增殖能力是含血清培养基条件下的一倍左右。2)改变基础培养基。董书伟等［10］通过对比昆明小鼠原始生殖细胞(PGCs)在不同组分的无血清培养基中的生长状况，发现在无血清培养基中添加0.1 mmol/L维甲酸(RA)或使用条件培养基 MEF-CM和 GR-CM，均有利于小鼠 PGCs的增殖，其中 MEF-CM和GR-CM组的效果与细胞因子组相比差异不显著且降低了培养基的成本。3)采用新的补充因子。田靓等对生物反应器细胞培养的无血清培养基的成分进行了优化，他们以稳定转染了抗 CD3人源化抗体的 CHO细胞为模型，将无血清培养基经生物反应器高密度细胞培养后分子量小于50kD的超滤液作为基础培养基，发现向其中添加2 mmol/L丁酸钠可以有效地诱导蛋白的表达;丁酸钠和柠檬酸铁对于促蛋白表达有协同作用，适量添加培养中消耗较快的氨基酸(丝氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸及亮氨酸)可提高蛋白数和蛋白的表达量［11］。张大鹤等［12］开发出适于重组 CHO-K1 细胞培养的无动物源、无蛋白培养基(PFM)及化学成分确定的培养基(CDM)。在 PFM中，以柠檬酸铁、硫酸锌和酵母水解物替换无血清、低蛋白培养基(SFMC)中的转铁蛋白、胰岛素和动物组织水解物。在CDM中，以PFM培养基为基础，调整和优化氨基酸的浓度和其他部分营养物质浓度。实验结果证明两种培养基均可稳定支持CHO细胞培养，微量元素完全可以替换无血清培养基中的蛋白，支持细胞生长和促进蛋白表达。通过对其他营养物质的优化调整，不需添加任何小肽化合物，在去除培养基中的蛋白水解物后，仍能支持高密度的 CHO 细胞培养［12］。

通过对无血清培养基成分的适当调整、改进，人们实现了对某一类细胞或细胞产物快速、专一的培养目的，但目前这种改进还未大规模投入生产，且培养的细胞种类具有一定的局限性。

3 无血清培养基在基础研究和生产实践中的应用与开发

由于无血清培养基具有组成成分相对清楚、性能更加一致、容易进行纯化和下游加工、培养细胞的功能可以精确评估、增强生长和产量、生理反应性可以较好对照、可增强细胞内中介物的检测等诸多优点，从而在动物细胞体外培养中的应用日益广泛。随着近年来人们对无血清培养基的不断研究，其应用与开发也愈加广泛。

3.1 用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品

樊庆帅等［13］研发出一种适合 MDCK细胞生长的无血清培养MDCK-SFM，以用于狂犬病病毒的生产。用MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒，可获得较高的病毒滴度(5.13 IgFFU/mL)，且成本低，成分比较明确，在 MDCK细胞高密度培养生产狂犬病疫苗方面具有较高的应用价值。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)被广泛的用作宿主细胞以生产重组蛋白用于临床诊断［14］。孙亚婷等［15］以表达单克隆抗体的重组CHO细胞为研究对象，研发出能支持细胞高密度培养和产物高效表达的无血清培养基，以优化后的无血清培养基对表达单克隆抗体的重组CHO细胞进行批式培养，其最高活细胞密度可达6×106cells/mL，单克隆抗体浓度达200 mg/L，比HyClone SFM4CHO商业无血清培养基中分别提高了50%和30%。

3.2 用于干细胞的体外培养和研究

干细胞具有可分化成为不同功能细胞的全能性，大量的研究结果已经表明干细胞将可能为目前许多不治之症(如肝硬化、心肌梗死、糖尿病、白血病等)提供有效的治疗手段，也是组织再生、器官移植等再生医学发展的希望所在，其重要性已经得到人们的广泛共识，干细胞研究和产业化进展迅速［16］。目前无血清培养基已被广泛用于干细胞的研究。方彦艳等［17］在无血清的人间充质干细胞专用培养基培养体系条件下，利用脐带组织培养法分离培养出大量的脐带间充质干细胞，避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。其实验表明脐带间充质干细胞(MSCs)易于诱导成骨，部分实现了筛选骨组织工程中候选的骨种子目的。陈请国等［18］利用无血清培养基培养大鼠神经干细胞，以观察其生长及分化情况。实验结论是:神经干细胞在无血清培养基中生长旺盛，8 d左右就可以形成胞体透亮、折光性好的干细胞球;神经干细胞的分化受微环境的影响，不同的生长因子能诱导其朝不同方向分化。

3.3 用于肿瘤的研究

肿瘤是急待攻克的世界性难题，人们在不断研究着肿瘤的发生机制、转移、治疗等方面，以期达到治愈肿瘤的目的。由于无血清培养基的优势明显，许多研究人员选择它来培养富集肿瘤细胞用于后续研究，发现其有良好的富集效果;研究人员通过向培养基中添加一些化学生物物质或药物，以研究其对肿瘤的影响及肿瘤的病因、病理等方面。所以无血清培养基在肿瘤研究方面得到了广泛应用。李雅婷等［19］用加了20 μ g/L EGF和20 μ g/L bFGF的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养，发现无血清培养条件下的SP2/0细胞比普通培养条件下的SP2/0细胞有更高的致瘤性和有更多的肿瘤干细胞(TSC)。虽然用无血清培养没有能够得到由SP2/0细胞TSC形成的肿瘤球，但是它对SP2/0细胞的TSC有富集作用。王欣荣等［20］利用无血清培养基悬浮培养小鼠乳腺癌细胞株4T1，发现4T1细胞可在含多种生长因子的SFM中悬浮生长并形成细胞球，4T1细胞中含有的乳腺癌干细胞样细胞可通过SFM培养法富集。

3.4 用于从多种细胞混杂的培养中选择目的细胞

通过对无血清培养基中的某些成分含量的调整或取舍，可抑制原代组织培养物中非目的细胞的过度生长，达到选择目的细胞的目的。胡祥等［21］旨在检测结直肠癌细胞系 SW480中侧群细胞(Side population，SP)亚群(SP细胞是一类不均一的群体，来源于成体组织的特殊干细胞类型，由不同等级的干细胞亚群组成，各亚群之间的表面抗原标记和细胞类型等存在较大的差异)，他们采用添加了表皮生长因子20 μl/L、碱性成纤维生长因子10 μ g/L的无血清培养基培养结肠癌细胞系SW480，初步分离、富集肿瘤干细胞样亚群。曾志勇等［22］采用无血清培养基 K-SFM培养人食管上皮细胞，培养基成分是左旋谷氨酰胺、表皮生长因子及牛垂体提取物，在使用之前还添加了双抗(青霉素、链霉素)，0.5 mg/L氢化可的松和5 mg/L胰岛素。他们发现与常规血清培养液培养相比，在 K-SFM培养液中，成纤维细胞的生长明显受抑，而食管上皮细胞具有生长形态好、活力旺盛、增殖力强、细胞融合快、不易老化等优点。

3.5 研究细胞体外分化的条件或方法

无血清培养基的组成可以是完全确知的化学物质，因而可根据研究的需要增减具有重要生物活性物质的种类和数量，这就为研究细胞分化的条件提供了有效的手段。Jeffrey R.Crawford等［23］认为采用无血清培养基培养小鼠脾细胞可以快速有效地研究一些因子对成纤维细胞分化的影响。采用无血清培养基培养鼠科动物的脾细胞，5天内分化为成纤维细胞。因子IL-13(白介素-13)和M-CSF可以在很大程度上增强成纤维细胞的分化，增强分化的最优细胞密度是1.75×106cells/mL。SAP和交联免疫球蛋白G会抑制小鼠脾细胞分化为成纤维细胞。冯年花等［24］研究了人诱导性多能干细胞(iPS细胞)体外定向分化为神经干细胞(NSCs)的方法，他们将人 iPS细胞悬浮培养4d形成拟胚体(EB)后经维甲酸(RA)诱导4d，诱导后的 EB在无血清培养基中筛选并扩增培养，得到的细胞经免疫荧光检测到 NSCs的标志物质。其研究表明:维甲酸(RA)结合无血清培养基筛选培养能高效率地获得NSCs。Fang Ning等［25］的研究表明成釉细胞无血清条件培养基(ameloblasts serum-free conditioned medium，ASF-CM)是一种诱导小鼠胚胎干细胞(mESCs)分化成口腔上皮细胞的良好方法。他们发现细胞在分化培养基中培养 14d后，成釉细胞特有蛋白:CK14、AMBN、AMGN的表达量的高低与 mESCs是否形成类胚体(EB)有关，在有EB形成的 mESCs中其表达量会高。其研究也显示:ASF-CM能够有效的诱导 mESCs通过形成EB，进而形成成釉细胞状细胞的途径分化。

3.6 用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究

Christian Riebeling等［26］以无血清培养基为基质，研究一些特定的生长因子对小鼠胚胎干细胞株D3分化的作用。他们将含有生长因子骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-4、激活素A和抗坏血酸的培养基培养小鼠胚胎干细胞株D3，发现其分化为心肌。此外，通过流式细胞仪检测细胞标记蛋白，发现它不仅分化为心肌细胞，同时也分化为神经细胞。他们的这种方法可以应用于同时检测对早期中胚层和神经外胚层分化发育的影响。

4 展望

在无血清培养基出现至今的短短几十年中，已经历了三次大的发展，虽然至今仍有诸多不足，如适用范围窄、培养基相对较难保存、成本较高等。但随着人们对细胞营养与代谢、细胞周期、细胞凋亡、信号转导以及外源蛋白表达机制等各方面机理认识的不断深入以及细胞培养基的设计与研究中更多科学便捷的方法技术的成熟和采用，必将为无血清培养基的开发及改善提供快捷通道［4］。因此，相信无血清培养基必将克服其不足，取得更大的突破，如适合多种细胞生长，具有广泛适用性、生产高效性，降低成本及安全风险，与发酵罐技术良好结合等，使之更广泛地应用于生产实践和基础研究，特别是对干细胞和癌症机理的研究，为人类造福。

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