中华鳖多态性微卫星标记跨物种扩增研究

卜兴江，聂刘旺

(安徽师范大学生命科学学院安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室，芜湖241000)

在爬行动物中，微卫星已经被用于遗传多样性评估和生态行为特征研究(如婚配模式和扩散模式)等方面［1-2］。尽管微卫星标记是强有力的研究工具，但微卫星位点的开发过程是费时费力且费用高的工作。因此，科研工作者利用微卫星两端的侧翼序列在基因组中特别是亲缘关系比较近的种间具有保守性这一特点，将某一物种已经开发出的微卫星位点应用到相近物种的相关研究工作中，并取得了良好效果，这就使得微卫星引物在种间的扩增成为可能。有关微卫星标记在近缘物种间相互借用的研究报道已有很多。比如，Lin等［3］利用从玳瑁分离鉴定的12个多态性微卫星位点对其它7种龟［太平洋丽龟(Lepidochelys olivacea)、两爪鳖(Carettochelys insculpta)、红耳龟(Trachemys scripta elegans)、蠵龟(Caretta caretta)、大鳄龟(Macrochelys temminckii)、绿海龟(Chelonia mydas)和黄腹彩龟(Trachemys scripta)］进行跨物种扩增检测，结果表明:在不同的龟种中，最少有8个微卫星位点能扩增出特异性产物，最多的12个微卫星位点全部能扩增出特异性产物。Dubut等［4］用来自欧洲鲤科15个种的503个个体对41个微卫星位点跨物种扩增情况进行了检测，结果发现，在这41个微卫星位点中，24～37个微卫星位点在不同物种中具有多态性，23个微卫星位点在所有的15个物种中都具有多态性。可见，借用相近物种微卫星标记既降低了费用，又省时省力;而且提高了微卫星的利用效率，为微卫星的推广应用提供了条件，这对于极度濒危物种研究意义更大。本研究拟对中华鳖新开发的21个微卫星位点进行跨物种检测，共检测了3科8种，它们是鳖科5个种:鼋(Pelochelys cantorii)、斑鳖(Rafetus swinhoei)、山瑞鳖(Palea steindachneri)、刺鳖(Apalone spinifera)和佛罗里达鳖(Apalone ferox);两爪鳖科的两爪鳖(Carettochelys insculpta);淡水龟科的黄喉拟水龟(Mauremys mutica)和乌龟(Chinemys reevesii)。通过本研究以期为还没有开发微卫星的近缘种，尤其是一些濒危物种提供这种强有力的研究工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 龟鳖类标本

本试验所用龟鳖类标本有:鼋、斑鳖、山瑞鳖、刺鳖、佛罗里达鳖、两爪鳖、黄喉拟水龟和乌龟8只个体均为实验室保存标本。

1.1.2 主要试剂和仪器

Taq DNA聚合酶(TIANGEN);DNA Marker II(TIANGEN)。ICYCLER梯度PCR仪(Bio-Rad);DYY-2C电泳仪;Tan 1600凝胶成像系统。21对微卫星引物［5］(表1)由上海生工生物工程公司合成，PAGE胶纯化。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

对8种龟鳖标本的基因组DNA的提取方法是常规的酚氯仿方法［6］，提取的基因组DNA经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后拍照。

1.2.2 21对微卫星引物的PCR扩增检测

用本实验室从中华鳖中成功分离得21个微卫星位点的引物［5］对上述的8种龟鳖进行PCR跨物种扩增检测，反应总体积为25 μL。循环参数为:94℃预变性5 min;94℃变性40 s，各引物退火温度45 s，72℃延伸45 s，35个循环;72℃终延伸10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后拍照。

表1 中华鳖21个多态性微卫星位点的相关信息Table 1 The information of 21polymorphic microsatellite loci from Pelodiscus sinensis

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取的电泳检测结果

8种龟鳖基因组DNA的提取结果如图1所示。1～8分别为:鼋、斑鳖、山瑞鳖、刺鳖、佛罗里达鳖、两爪鳖、黄喉拟水龟和乌龟所提取的基因组DNA，均显示无明显降解现象，提取效果较好，适合进行下一步实验操作。

图1 8种龟鳖基因组DNA检测结果Fig 1 The result of the genomic DNA for eight species of turtle

图2 跨物种扩增电泳检测图Fig 2 The PCR products of cross-species amplification

2.2 跨物种扩增结果

21对中华鳖微卫星引物对上述的8种龟鳖(鼋、斑鳖、山瑞鳖、刺鳖、佛罗里达鳖、两爪鳖、黄喉拟水龟和乌龟)进行PCR跨物种扩增检测结果如表2所示;跨物种扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳中的结果如图2，除CST16引物在8个物种中都没有扩增成功外，其余的20对引物对8个物种的扩增产物检测图见图2，图中所示1～8分别为:鼋、斑鳖、山瑞鳖、刺鳖、佛罗里达鳖、两爪鳖、黄喉拟水龟和乌龟采用不同引物对的PCR扩增产物。

表2 跨物种扩增结果Table 2 Cross-species amplification of 21 microsatellite loci

从上表可以看出，就微卫星位点而言，4个微卫星位点(CST21、CST42、CST50和CST52)引物能在所有8只个体中稳定扩增;而CST16在所有个体中都不能扩增出目的片段。就物种而言，跨物种扩增山瑞鳖结果最好，21个位点中有20个位点能稳定扩增;而乌龟扩增效果最差，只有6个位点能被扩增出目的产物。鳖科中的5个物种和其它两科的3个物种相比，鳖科物种能被扩增出目的片段的微卫星位点数明显的多于另两科的物种，这也说明鳖科内的物种与中华鳖亲缘关系更近，这也符合实际情况。同时，同是鳖科的5个种也分成两派，鼋、斑鳖和山瑞鳖能稳定扩增的位点数相似，而刺鳖和佛罗里达鳖能稳定扩增的位点数相似;且前者多于后者，这可能与它们的地理分布有关系。综上，中华鳖的21个微卫星位点多数可以在鳖科内各属间进行跨物种扩增，部分可以在跨科物种间扩增。

3 讨论

3.1 物种选择

在进行跨物种扩增实验的物种选择方面，主要基于两方面考虑:一方面，样本可获得性，因为鳖科内很多种都是濒危和极度濒危物种，如极度濒危物种斑鳖，目前，全球报道的仅有四只活体，中国有两只;鼋和山瑞鳖属于濒危物种。可见样本很难获得。本实验室长期从事龟鳖动物研究，经过不断的积累，尽管某些种的个体数很少，但种类还是比较广泛的。另一方面，种属的代表性，鳖科内并不是所有属的种都能得到个体，这样就选择在国内有分布的种(亚洲范围内)，另外选了美洲地区的两个种(刺鳖和佛罗里达鳖)做对比。之所以选择两爪鳖科和淡水龟科的物种做跨科比较，主要是因为淡水龟科是现生龟鳖目动物中种类最多、形态上变异最为多样的一个自然类群，绝大多数物种的成种时间都较晚，大约发生在最近的5000万年［7-8］;且黄喉拟水龟和乌龟也是分布较广的种。而两爪鳖科只有一个种就是两爪鳖(又叫猪鼻龟)，其在龟鳖目的归属存在争议，Gaffney等［9］基于形态学证据，将其归入鳖超科;Krenz等［10］基于核重组激活酶基因1(RAG-1)和两个线粒体基因数据分析了24个龟鳖的系统进化关系，构建了3个系统发生树(MP树、ML树和BI树)得到了两个不同的结果，MP(Maximum parsimony)树分析表明可将龟鳖目分成3支:两爪鳖科(两爪鳖)，侧颈龟科(非洲侧颈龟)和一支由其它所有现存龟类组成的进化支;而 ML(Maximum likelihood)树和 BI(Bayesian)树支持将两爪鳖科和鳖科归为鳖超科，与曲颈龟亚目其它物种共同构成姐妹群。Li等［11］利用线粒体全序列(去除控制区部分)构建了MP树、ML树和BI树，结果显示，在MP树中，龟鳖目被分为3大支:侧颈龟科(Pelomedusidae)，两爪鳖科(Carettochelyidae)和一支由曲颈龟亚目的18种龟鳖类聚成的进化支，此结果支持将两爪鳖科提升到亚目的水平。然而ML树和BI树则支持两爪鳖科和鳖科构成姐妹群，再同其它曲颈龟物种共同聚为一支，支持将现今龟鳖类分为两大支:曲颈龟亚目(Cryptodira)和侧颈亚目(Pleurodira)。可见两爪鳖科归属的争议还有待于采用更多的分子数据进行深入研究。

综上所述，如果中华鳖微卫星位点不仅能跨物种稳定扩增，而且具有多态性，那么为近缘物种的分类地位、进化历史及遗传多样的研究提供了极大地便利。由于受到样本尤其是濒危和极度濒危样本数量的限制，本研究仅对这几个种进行了引物跨物种PCR检测，虽然部分引物能稳定扩增，但是否具有多态性还需进一步检测，这有待在做相应物种研究时加以验证确定。

3.2 跨物种扩增存在的问题

尽管微卫星标记在近缘物种间相互借用有诸多优点和好处，但也不可否认微卫星引物的跨物种扩增也存在一些问题。如异源同形(size homoplasy)现象的存在［12-13］，就是一个众所周知的跨物种扩增所存在的问题。所谓“异源同形”就是指与微卫星位点的PCR扩增产物长度相同，但是遗传组成不完全相同的等位基因。这些不同等位基因的产生主要是由于重复侧翼区的突变事件(删除或插入)或是由于完全型微卫星重复中断产生了相同大小等位基因所引起的。微卫星的异源同形现象已有许多报道［14-16］，并被认为是跨物种扩增中最主要的问题;而且随着物种分歧时间的延长异源同形现象有增加的趋势［13］。但也有研究认为异源同形在种群遗传学分析中并不是多大的问题，微卫星位点广泛的变异性可以弥补异源同形现象的发生［17］。跨物种扩增除了会出现异源同形问题外，最近，岳根华等［18］对属于 3个不同科(Clariidae、Heteropneustidae和Pimelodidae)的7个鲶鱼物种的微卫星跨物种PCR扩增产物进行了序列分析，研究发现扩增非同源(non-orthologous)产物是微卫星跨物种PCR扩增的一个新问题，也就是在跨物种扩增过程中出现了非同源位点，此位点与原来的微卫星位点是完全不同的DNA序列。

可见，微卫星跨物种扩增产生的非同源产物和等位基因大小异源同形将使系统发育、群体遗传学和进化研究明显复杂化。因此，在应用微卫星跨物种扩增数据之前，最好能对跨物种扩增产物进行测序验证，以避免非同源产物和异源同形的干扰。

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