HPLC法测定复方芩苍鼻喷雾剂中黄芩苷的含量

韩宪忠，金蜀蓉，柯昌毅，谢剑锋（重庆市第三人民医院，重庆 400014）

鼻炎是发生在鼻腔黏膜的炎性疾病，为耳鼻喉科常见病、多发病。其临床症状主要表现为鼻内发痒、打喷嚏、流清鼻涕、鼻堵塞等，严重影响患者的生活质量[1]。古方“苍耳散”具有散风祛湿、通九窍、抗菌等作用，治疗鼻炎效果显著[2]。笔者根据临床需要，结合现代中医药理论，参考古方“苍耳散”与“鼻康合剂”处方并进行加减，重新组方并精制成了复方芩苍鼻喷雾剂。为保证该制剂的质量，本试验建立了复方芩苍鼻喷雾剂中黄芩苷的含量测定方法。

1 材料

1.1 仪器

Waters高效液相色谱（HPLC）仪，含1525二元泵、2487双波长紫外检测器、717自动进样器、Breeze色谱工作站（美国Waters公司）；AR1140电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-500超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率：500 W，频率：40 kHz）。

1.2 药品与试剂

复方芩苍鼻喷雾剂（重庆市第三人民医院自制，批号：110112、110113、110119）；黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110715-200815）；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。试验前所有液体试剂均经0.45 μ m微孔滤膜滤过。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2，V/V/V）；检测波长：280 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：20℃；进样量：10 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取黄芩苷对照品3.10 mg，置于10 ml量瓶中，用少量甲醇经超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得310 μg/ml的对照品贮备液。再精密量取该贮备液2 ml，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得62 μg/ml的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品2 ml，置于100 ml量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

以相同处方比例的空白辅料制得空白样品，照“2.3”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.5 系统适用性试验

取“2.2”项下对照品贮备液，按“2.1”项下色谱条件进样10 μl，记录色谱图。结果，理论板数按黄芩苷峰计算应为4564，表明柱效良好。

2.6 检测波长的选择

参照2010年版《中国药典》（一部）黄芩药材的含量测定方法，选择280 nm为检测波长。

2.7 专属性试验

取上述对照品、供试品、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件注入HPLC仪，绘制色谱图。结果显示，阴性对照在与黄芩苷对照品色谱图相应位置上未见干扰；供试品在与对照品色谱图相应保留时间位置上有相应的色谱峰，并且与相邻峰有较好的分离。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.8 线性关系考察

分别精密量取质量浓度为310 μg/ml的黄芩苷对照品贮备液0.2、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0ml，置于10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为 6.2、31.0、62.0、124.0、310.0µg/ml的系列溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样10 μl，测定峰面积。以黄芩苷进样量（x）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝40248 x－72915（r＝0.9993，n＝6）。结果表明，黄芩苷的质量浓度在6.2～310.0 μ g/ml范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.9 精密度试验

精密吸取黄芩苷对照品溶液（62 μg/ml）连续进样6次，每次10 μl，记录色谱图。结果，RSD＝1.04%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.10 重复性试验

精密量取同一批样品2 ml，共6份，分别置100 ml量瓶中，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按拟定方法进行含量测定。结果，样品中黄芩苷的平均质量浓度为24.60μg/ml，RSD＝1.69%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.11 稳定性试验

精密量取同一供试品溶液适量，分别于0、4、8、16、24 h时按拟定方法进样测定。结果，RSD＝0.56%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.12 加样回收率试验

取已知黄芩苷含量的同一批样品0.1 ml，共9份，每3份为一组，分别按低、中、高质量浓度精密加入黄芩苷对照品贮备液各适量，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按拟定方法测定含量，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.13 样品含量测定

取3批样品各适量，分别照“2.3”项下方法制备供试品溶液，各取10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别进样3次，记录色谱图，并以外标法计算样品中黄芩苷的质量浓度，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

3 讨论

HPLC法分离效能高、分析速度快、应用范围广，其重现性和准确度均优于薄层色谱扫描法，现已作为中药及其制剂的常规含量测定方法[3]。黄芩苷为含羟基的黄酮类化合物[4]，极性较大。笔者通过对文献报道的多种流动相进行试验，并参考2010年版《中国药典》[5]，以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2，V/V/V）为流动相，其中磷酸可作为解离抑制剂，抑制组分解离，增强保留[6]。该条件下黄芩苷峰与相邻峰能较好的分离，对称性好，故选用此流动相。

试验中发现，温度对黄芩苷的保留时间有一定影响：当温度在20℃左右时，黄芩苷的保留时间在10.2 min左右；当温度在30℃左右的时候，黄芩苷的保留时间会降至7.6 min左右。Yang Y等[7]发现随着柱温的升高，极性和非极性物质的保留因子都减小。因此，为了保证色谱峰出峰时间的一致性，如没有温箱，应尽量保证柱温的相对一致性，以减少由于温差造成保留时间的较大变化。

试验结果表明，本方法简便、快速、准确、重复性好，可用于复方芩苍鼻喷雾剂中黄芩苷的含量测定和该制剂的质量控制。

[1]张罗，韩德明，王琪，等.鼻炎概述[J].中国耳鼻咽喉头颈外科，2007，14（1）：19.

[2]李宏伟.辛夷苍耳散加减治疗急慢性鼻窦208例观察[J].中国社区医师，2010，13（12）：123.

[3]黄其春，徐文升.HPLC法测定痰热清注射液中黄芩苷的含量[J].中国药房，2008，19（30）：2388.

[4]江纪武，肖庆祥.植物有效成分手册[M].北京：人民卫生出版社，1986：111.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：391.

[6]李发美.分析化学[M].6版.北京：人民卫生出版社，2008：398.

[7]Yang Y，Jones AD，Eaton CD.Reerention behavior of phenols，anilines，and alkylbensenes in liquid chromatographic separations using subcritical water as the mobile phase[J].Anal Chem，1999，71（17）：3808.