Nodosin在水中的平衡溶解度和稳定性研究Δ

尚校军，马素英，邵芃，闫福林#（.新乡医学院药学院，河南新乡453003；.新乡医学院基础医学院，河南新乡 453003）

Nodosin是从香茶菜属植物溪黄草中分离出的一种二萜类化合物，体外活性研究显示其具有明显的抗癌活性[1-3]。但对nodosin在水中的溶解度以及在水溶液中稳定性的研究很少，为此，笔者进行了上述内容的研究，为nodosin药物剂型研发提供试验数据。

1 材料

1.1 仪器

LC-6 AD高效液相色谱（HPLC）仪（日本岛津公司）；pHS-3 TC数显pH计（上海天达仪器有限公司）；BS224 S电子分析天平（德国赛多利斯公司）；SHA-C水浴恒温振荡器（江苏金坛佳美仪器有限公司）；CH1015超级恒温水槽（上海衡平仪器仪表厂）。

1.2 试剂

nodosin对照品（新乡医学院药学院天然药物化学教研室自制，纯度＞98.0%）；甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 nodosin含量测定方法[4]

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Sion Chrom ODS-bp（200mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（60∶40，V/V）；检测波长：231 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：38℃。在此色谱条件下，nodosin的保留时间约为5.45 min。色谱见图1 A。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称定用五氧化二磷干燥至恒质量的nodosin对照品19.8 mg，置于25 ml量瓶中，加流动相溶解并定容，制成nodosin质量浓度为792 μg/ml的贮备液。分别精密量取此贮备液50、100、500、1000、1500、2000μL，置于10 ml量瓶中，加流动相制成nodosin质量浓度分别为3.96、7.92、39.60、79.20、118.80、158.40 μg/ml的溶液，分别取上述溶液20 μL，按上述色谱条件测定。以药物质量浓度（c）对峰面积积分值（A）进行线性回归，得回归方程为c＝0.0519 A+0.0599（r＝0.9998，n＝6）。结果表明，nodosin质量浓度在3.96～158.40 μg/ml范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.2 平衡溶解度的测定

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

称取过量nodosin，置于10 ml具塞玻璃试管中，精密加入蒸馏水3 ml，将试管放在（25±0.5）℃恒温水浴振荡器中振摇12 h，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液经适当稀释后，取样20 μL，按上述色谱条件测定nodosin的质量浓度，并计算溶液中nodosin的平衡溶解度。结果，25℃下，nodosin在水中平衡溶解度为38.33 mg/L。根据《中国药典》规定，nodosin属于不溶性药物。

2.3 nodosin水溶液稳定性考察

2.3.1 样品溶液的制备 精密称取nodosin 6.5mg，置于200 ml量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，得32.5μg/ml的nodosin样品溶液。

2.3.2 经典恒温法预测药物水溶液在室温下的稳定性 精密量取样品溶液15 ml，置于具塞玻璃试管中，密封。分别在40、50、60、70、80℃恒温水浴中避光保存30 h，分别于0、2、6、12、24、30 h各取样0.5 ml，取样20 μl，按上述色谱条件测定nodosin的质量浓度，并绘制药物降解曲线。30 h，80℃nodosin水溶液的HPLC见图1 B；不同温度下nodosin水溶液的降解曲线见图2。

图2 不同温度下nodosin水溶液的降解曲线Fig 2 Degradation curves of nodosin solution at different temperatures

由图2可知，nodosin在水中的降解随着温度的升高而加快。将其在不同温度下的降解数据分别代入零级、一级和二级反应方程进行拟合，详见表1。

表1 不同温度下nodosin的降解拟合方程Tab 1 Fitted equation of nodosin degradation at different temperatures

由表1可知，零级、一级、二级反应方程拟合结果都可接受。综合评价，一级反应方程拟合效果最好，并且一级反应的速率常数（K）与药物质量浓度无关，适用范围广，因此选用一级反应方程计算nodosin水溶液降解的K。

表2 nodosin水溶液在25、4℃下反应速率相关参数Tab 2 Related parameter of reaction rate of nodosin solution at 25、4℃

图3 nodosin水溶液的Arrhenius图Fig 3 Arrhenius map of nodosin solution

由表2可知，nodosin水溶液在25℃下的t90为190.22 h，在4℃下t90为2299.37 h。

2.3.3 pH值对nodosin水溶液稳定性的影响 精密量取“2.3.1”项下样品溶液8 ml，分别用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH溶液调样品溶液pH值分别为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，再用同样pH值的空白溶液定容至10 ml，摇匀密封，在室温下避光放置30 h，分别于0、2、6、12、24、30 h各取样0.5 ml，经过适当稀释，取样20μl，按上述色谱条件测定nodosin质量浓度。根据一级反应方程，分别计算各pH值下nodosin的降解K，以lgK对pH值作图，绘制pH-速率曲线，考察pH值对药物稳定性的影响。结果，nodosin水溶液降解的pH-速率曲线呈V型，根据曲线的走向趋势，nodosin在酸性条件下比在碱性条件下稳定，当pH值在5～7范围内时，溶液最稳定。故可以判断，nodosin水溶液的降解受溶液pH值影响，属于酸碱催化反应。nodosin在30 h，pH 1.0溶液和12 h，pH 11.0溶液中的HPLC分别见图1中C、D；nodosin水溶液降解的pH-速率曲线见图4。

图4 nodosin水溶液降解的pH-速率曲线Fig 4 pH-degradation rate curves of nodosin solution

3 讨论

药物稳定性考察是处方前研究的重要组成部分，对选择合理剂型和制剂工艺具有重要指导意义。

本试验研究显示，nodosin在水中溶解度较小，水溶液也不稳定，而且随着温度升高，降解加速。25℃室温下，nodosin的有效期t90仅为190.22 h，4℃下t90为2299.37 h。

nodosin的稳定性还受环境中酸、碱性的影响，属于酸碱催化的降解反应，尤其在碱性环境中，降解速度比酸性环境快，在pH 5～7范围内的中性偏酸环境中，较为稳定。因此，对于nodosin的血管外给药制剂适宜选择固体剂型，静脉给药制剂适宜制成注射用无菌粉末，并且制备过程中还要注意溶液受pH值和温度的影响。

[1]Yan FL，Wang CM，Guo LQ，et al.A new ent-kaurane diterpenoid from Isodon nervosus[J].J Chem Research，2008，2008（9）：522.

[2]海广范，闫琰，刘巨源，等.Enmein、serrinB、nodosin和lasiodonion对HL60细胞株和lovo细胞株的增殖抑制作用[J].新乡医学院学报，2008，25（6）：564.

[3]He F，Xiao WL，Pu JX，et al.Cytotoxic ent-kaurane diterpenoids from Isodon sinuolata[J].Phytochemistry，2009，70：1462.

[4]倪林，李树华，卢海啸，等.HPLC法测定显脉香茶菜中Nodosin的含量[J].广东药学院学报，2010，26（6）：605.