RP-HPLC法测定注射用磷酸肌酸钠有关物质的含量

郭兴辉，王倩雯（1.河南省食品药品检验所，郑州450000；.中山大学药学院，广州516000）

磷酸肌酸钠是一种心肌保护剂，临床上用于治疗横纹肌活性不足，是心肌疾病的辅助治疗药物[1]。2010年版《中国药典》二部未收载该原料药及制剂，其质量标准收载于进口药品质量标准中，且仅对其总杂质的量进行了控制，在其他文献中未见有关磷酸肌酸钠有关物质的报道。为更好地控制药品质量，本文建立了反相（离子对）高效液相色谱（RP-HPLC）法测定注射用磷酸肌酸钠中已知杂质肌酸、肌酸酐和磷酸肌酸酐的含量。经方法学考察，线性关系良好、专属性好、回收率满意，且操作快速、结果准确，同时对其他有关物质也进行了控制[2]。表明所建立的方法适用于该原料药合成及制剂分装前生产过程中的质量控制。

1 材料

2695 HPLC仪、2996二极管阵列检测器（PDA）、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；AE-240电子分析天平（上海梅特勒-托利多公司）。

注射用磷酸肌酸钠（由某公司提供，批号：20111211、20111221、20111231，规格：每瓶0.5 g）；肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为：100876-200901、100877-200901、C1413、100875-200901，纯度分别为：99.7%、99.2%、97.8%、76.2%）；四丁基磷酸氢铵为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.005 mol/L四丁基磷酸氢铵溶液（取四丁基磷酸氢铵1.7 g，加水900 ml使溶解，用20%磷酸钠调节pH值至7.0，用水稀释至1000 ml），流速：1.0 ml/min；溶剂：水；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：10 μl。理论板数按磷酸肌酸钠峰计为7854。

2.2 空白试验

注射用磷酸肌酸钠由磷酸肌酸钠原料药无菌分装制成，没有辅料添加，因此，取有关物质测定时溶解样品的溶剂10 μl，按上述色谱条件进样测定。结果溶剂不干扰样品中肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐和其他有关物质的测定，见图1。

2.3 肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐线性关系考察

取肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐对照品适量，精密称定，加水制成含肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐50、50、100 μg/ml的混合溶液，分别稀释成不同质量浓度（肌酸、肌酸酐为10、25、50、75、100、125 μg/ml，磷酸肌酸酐为20、50、100、150、200、250 μg/ml）溶液注入色谱仪，记录色谱图。以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行回归，得回归方程分别为：肌酸：y＝915.69x+5.6519（r＝0.9999，n＝5）；肌酸酐：y＝2664.5x－4.7182（r＝0.9999，n＝5）；磷酸肌酸酐：y＝1117.6x+4.8245（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，肌酸、肌酸酐检测质量浓度线性范围为10～125 μg/ml；磷酸肌酸酐检测质量浓度线性范围为20～250 μg/ml。

2.4 检测限和定量限

取“2.3”项下的混合溶液及磷酸肌酸钠对照品溶液稀释后进样，当信噪比为3∶1时，肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸钠检测限分别为0.5、0.25、2.0、0.5 ng；当信噪比为10∶1时，定量限分别为1.0、0.5、1.5、1.0 ng。

图1 磷酸肌酸钠专属性试验高效液相色谱图A.溶剂；B.未经破坏样品；C.酸破坏样品；D.碱破坏样品；E.高温破坏样品；F.氧化破坏样品；G.光破坏样品；1.磷酸肌酸钠Fig 1 HPLC chromatograms of specificity test of creatine phosphate sodiumA.solvent；B.undestroyed samples；C.samples destroyed by acid；D.samples destroyed by alkali；E.samples destroyed by high temperature；F.samples destroyed by oxidation；G.samples destroyed by high light；1.creatine phosphate sodium

2.5 精密度和稳定性试验

取“2.3”项下混合溶液，重复进样6次，以峰面积计算RSD，结果分别为肌酸：0.33%，肌酸酐：0.17%，磷酸肌酸酐：0.61%，表明该方法精密度良好。取上述溶液，在2～8℃温度条件下，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，测定肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐峰面积，结果RSD分别为0.60%、0.88%、1.32%，表明混合溶液在2～8℃温度条件下10 h内基本稳定。

2.6 回收率试验

取供试品（批号：20111211）约50 mg，共9份，精密称定，分别加入肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐混合溶液（500、500、1000 μg/ml）0.8、1.0、1.2 ml各3份，置于10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算含量及回收率。结果，肌酸的平均回收率为100.9%，RSD＝1.3%；肌酸酐平均回收率为99.2%，RSD＝1.2%；磷酸肌酸酐平均回收率为99.8%，RSD＝0.8%。表明该方法准确度良好，基本满足肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐的测定要求，详见表1、表2、表3。

2.7 专属性试验

取供试品（批号：20111211）约50 mg，共6份，进行不同条件下的降解试验，试验条件分别为：（1）未经破坏；（2）酸破坏：加入0.1 mol/L的盐酸溶液2 ml，室温放置20 min后用碱中和；（3）碱破坏：加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液2 ml，室温放置20 min后用酸中和；（4）高温破坏：样品在120℃烘箱中放置1 h；（5）氧化破坏：加入30%的双氧水0.5 ml，室温放置20 min；（6）光破坏：在1500 lx的强光下照射12 h。以上样品均用水溶解制成5 mg/ml的溶液，摇匀，测定。结果，所有降解产物与主峰的分离度均符合要求，表明该方法的专属性较强，色谱见图1。

表1 肌酸回收率试验结果（n＝9）Tab 1Results of recovery test of creatine（n＝9）

表2 肌酸酐回收率试验结果（n＝9）Tab 2Results of recovery test of creatinine（n＝9）

表3 磷酸肌酸酐回收率试验结果（n＝9）Tab 3Results of recovery test of creatinine phosphate（n＝9）

2.8 样品中肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐及其他有关物质的含量测定

3种已知杂质采用对照品对照法计算含量，有关物质采用主成分自身对照法计算含量。取供试品适量，加水溶解并制成5000 μg/ml的溶液作为供试品溶液；将供试品溶液稀释成50 μg/ml的溶液作为对照溶液；取肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐对照品适量，加水溶解制成50、50、100 μg/ml的溶液作为对照品混合溶液。进样测定，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。结果，供试品溶液和对照品混合溶液色谱见图2，数据结果见表4。

3 讨论

3.1 波长的选择

图2 有关物质测定高效液相色谱图A.供试品溶液；B.对照品混合溶液；1.肌酸；2.肌酸酐；3.磷酸肌酸酐Fig 2 HPLC chromatograms of related substance testsA.test sample solution；B.mixed solution control；1.creatine；2.creatinine；3.creatinine phosphate

表4 3批样品中有关物质含量测定结果（%%）Tab 4 Results of content determination of related substance in 3 batches of samples（%%）

采用本文选定的色谱条件，分别对流动相、溶剂、磷酸肌酸钠对照品、肌酸对照品、肌酸酐对照品、磷酸肌酸酐钠对照品采用PDA检测。结果，肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸钠的最大吸收波长均为210 nm，因此选定210 nm为有关物质检查的检测波长。综合HPLC-PDA检测和专属性试验结果可以看出，磷酸肌酸钠及其杂质在210 nm波长处均可以检出，试验溶液在各种破坏条件下有关物质均能有效检出，主峰与杂质峰之间能够良好地分离。因此，选择210 nm作为有关物质检测波长能有效检出杂质，未漏检杂质峰。

3.2 流动相的选择

分别采用0.04、0.05、0.06 mol/L的四丁基磷酸氢铵溶液，并分别调pH为6.8、7.0、7.2，在25、30、35 ℃的柱温条件下，对磷酸肌酸钠进行测定。结果发现流动相浓度为0.05 mol/L、pH值为7.0、柱温为30℃时，磷酸肌酸钠峰的保留时间合适，峰形好，柱效高。同时对不同品牌的色谱柱进行比较，发现Waters C18柱较Diamonsil C18柱分离效果好、耐用性强。故选作本文的色谱条件进行分析。

3.3 溶液稳定性

试验中发现，制备好的溶液在室温放置时，随着放置时间的延长，磷酸肌酸钠峰面积随之减小，有关物质的含量相应增加，对含量和有关物质测定结果影响较大。故建议制备好的溶液于2～8℃温度条件下保存[3]，且宜临用新配。

综上，本文建立的方法灵敏度高、专属性强，可用于注射用磷酸肌酸钠中有关物质的质量控制。

[1]王汝卫.磷酸肌酸的药理与临床应用[J].首都医药，1999，6（5）：32.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：172-176.

[3]祁广建，沈国英，王毅，等.离子对色谱法测定磷酸肌酸钠的稳定性[J].中国医院药学杂志，2004，24（1）：11.