二神散的气质联用分析及凝血活性研究

刘亚萍,陈佩东

(1.南京中医药大学附属一院,江苏南京210029;2.南京中医药大学,江苏南京210046)

二神散方出自《普济方》,组成为香附子一两(烧存性),蒲黄一两(炒),临床可用于淋证的治疗。淋证分为热淋、血淋等6种证型[1]。淋证由于肝主藏血,肝郁化火,造成气滞血瘀。香附、郁金等药物使血不妄行、瘀血去而新血生[2],而蒲黄炭具有化瘀止血的功效[3]。香附中主要有单萜和倍半萜类化合物a-蒎烯、香附烯、香附酮等挥发性成分[4-5],而香附醋品和炭品中的化学成分含量发生变化[6-7]。蒲黄主要含有黄酮类成分,如香蒲新苷,异鼠李素、槲皮素、柚皮素等[8],蒲黄挥发油成分主要为烷烃类[9]。蒲黄具有止血、化瘀、通淋的功效,具有影响凝血活性[10]。本文通过气质联用法(GC/MS)对二神散中的化学成分进行分析,研究二神散的凝血作用。

1 仪器与试药

Agilent 6890 GC-MS;LG-PABER血小板聚集凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器公司)、离心机(上海安寿科学仪器厂),所用试剂均为分析纯。

试剂盒:凝血酶原时间测定试剂盒(PT,批号:STG20101-46)、活化部分凝血活酶时间测定试剂盒(APTT,批号:ST20201-52)、凝血酶时间测定试剂盒(TT,批号:STG20301-35)、纤维蛋白原时间测定试剂盒(FIB,批号:STG20401-33),生产厂家均为北京世帝科学仪器公司。

蒲黄药材采自内蒙古巴彦淖尔市五原县境内,香附生品购于安徽铜陵(批号100326)经南京中医药大学吴启南教授鉴定分别为香蒲科植物水烛香蒲的干燥花粉和莎草科植物莎草的干燥根茎。按2010版药典炮制方法,蒲黄炒为黄褐色,香附炒成外表焦黑色。SD大鼠,雄性,体质量(200±20)g,购自浙江省实验动物中心,许可证号:SCXK(浙)2008-0033。

2 方法与结果

2.1 GC/MS成分分析

2.1.1 色谱条件 色谱柱柱温升温程序:100℃保持1 min,以1℃/min升温至180℃,保持1 min;继续以6℃/min升温至 220℃,保持 5 min。进样口温度220℃,检测器(FID)温度250℃。载气:高纯氦气,流量1.0 mL/min,空气400 mL/min,氢气30 mL/min。分流进样 ,分流比 50∶1,进样量 1.0 μ L 。

2.1.2 质谱条件 EI离子流;电子能量70 eV;质量扫描100.0～550.0;四极杆温度150℃;离子源230℃;离子倍增电压1 500V;GC/MS接口温度280℃。

2.1.3 样品制备 取香附炭品和蒲黄炭品各50 g,加水800 mL,水蒸气蒸馏提取,无水硫酸钙吸水,取0.1mL挥发油提取物,置于1mL容量瓶,加入甲醇定容,滤过,即得。将制得的供试品采用自动进样进行GC/MS检测,导出数据。

2.1.4 分析结果 二神散的挥发油提取物经气相色谱石英毛细管柱分离,质谱仪记录质谱图,得到GC/MS总离子流图,见图1。各色谱峰相应的质谱图经计算机谱库检索确定其化学结构,并用峰面积归一化法测定其相对含量,见表1。

2.2 凝血活性研究

2.2.1 样品制备 参考临床用量,二神散(蒲黄炭∶香附炭=1∶1)50 g以15倍量水煎煮提取2次,合并滤液并浓缩为1 g/mL。实验前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液将云南白药、二神散水提浓缩液混匀并稀释至所需浓度。

图1 二神散总离子流图

2.2.2 血瘀模型 取大鼠40只,雄性,体质量(200±20)g,随机分为4组,分别为空白组、血瘀模型组、云南白药组0.27 g/kg、复方组8.4g/kg,每组10只。正常组与模型组灌胃给药0.5%羧甲基纤维素钠溶液2 mL/100 g,其余组灌胃等体积的相应药物,每日1次,连续7 d。第6天给药后禁食,除空白组外,其余组背部皮下注射盐酸肾上腺素1 mL/kg,共2次,中间间隔4 h,并在第一次注射4 h后将大鼠浸入0～2℃冰水冰浴5 min,复制急性血瘀大鼠模型,正常组注射等体积的生理盐水。次晨各组给药40 min后颈总动脉插管取血放入事先装有枸橼酸钠溶液(3.8%)的试管中。

表1 二神散GC/MS图谱中的主要化学成分

将所取血液以3 000 r/min离心10 min分离血浆,并按试剂盒的要求及操作步骤测定各组血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原时间(FIB),结果见表2,表3。

表2 二神散对凝血酶原时间(PT)、凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原时间(FIB)的影响( x±s,n=10)

3 讨论

经GC/MS检测二神散挥发油提取物共分析出62个化合物,其中18个成分含量超过1%。香附具有疏肝理气、调经止痛的作用[11],而香附炭主要用于妇女崩漏不止,表现出生行熟止的功效差别,香附炒炭后主要成分香附酮含量剧烈下降[6],本实验中香附酮含量下降明显。

表3 PT、APTT、TT的抑制率( x±s,n=10) %

淋证常有气滞血瘀的症状,所以本实验采用了血瘀型大鼠模型,实验结果表明,二神散组能显著缩短血瘀模型大鼠凝血酶原酶形成阶段外源性途径,显著缩短血瘀模型大鼠凝血时间,能作用于纤维蛋白形成阶段而显著降低血瘀模型大鼠纤维蛋白原含量,说明二神散能通过促进凝血而表现出止血作用。

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