通天草提取物对拟阿尔茨海默氏病模型大鼠学习记忆能力及其海马区组织相关蛋白表达的影响

魏铁花,李宝龙,刘 旭,贾博宇,周忠光＊,尹丽颖

(1.深圳市光明新区人民医院康复科,广州深圳518000;2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江哈尔滨150000)

阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是老年痴呆最常见的一种类型[1-2]。AD是一种多因素相关的复杂性疾病,针对单靶点或单致病途径的药物疗效欠佳。对于针对多靶点、多途径治疗,中药提取物有其独特的优势,有望在AD的药物干预领域实现新的突破。通天草(waternut Herb,herba eleocharitis)是莎草科植物荸荠(eleocharis dulci)的干燥地上茎,性轻清上逸,可引诸药入脑,具有补脑、改善脑部血液循环、剔除脑络瘀血的作用,常被用作治疗心脑血管疾病的引经药[3]。通天草醇提物和水提物对老年痴呆大鼠脑氧化性损伤具有保护作用,是近年中药用于治疗AD的重点研究药物之一[4]。本研究旨在探讨通天草提取物对拟AD模型大鼠学习记忆能力的影响,以及脑组织的病理学变化,试图阐明通天草提取物抗AD的作用及其机制。

1 材料

1.1 药品与试剂 兔抗 NF-κ Bp65、Iκ B-α、GFAP 、S100β多克隆抗体(北京博奥森生物工程有限公司);标准品Aβ1-40(购自Sigma公司),无菌生理盐水配制成5 g/L,密封37℃恒温箱培养1周,之后-20℃冰箱中保存备用。其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所);微量移液器(美国THERMO公司);生物显微镜(德国Leica公司);ChampGel-3200数字成像仪(北京赛智科技有限公司);SN-2大鼠脑立体定位仪(日本)。

1.3 动物及分组 Wistar大鼠96只,雄性,体质量220～250 g,购自黑龙江中医药大学实验动物中心。随机均分为8组:①阴性对照组、②假手术组、③AD模型组、④西药治疗组、⑤醇低组、⑥醇高组、⑦水低组、⑧水高组。在屏障动物实验设施内正常饲养,给予充足饮水,自由摄食,自然光照。

2 方法

2.1 Aβ1-40海马微量注射模型组 Aβ1-40海马内注射制造老年性痴呆动物模型是一种公认的方法[5]。选择大鼠右侧海马为注射靶区,经10%水合氯醛腹腔麻醉后,在前囟后3.5 mm,中线向左旁开2 mm处确定注射点。用微量注射器向脑组织内缓慢注射Aβ1-40溶液 2 μ L(10 μ g),牙科泥封住颅骨孔,术区用消炎粉消炎,缝合皮肤并消毒。假手术组选择大鼠右侧海马注入等量生理盐水,其它过程同上。阴性对照组不作任何处理。单笼饲养至大鼠完全清醒。

2.2 通天草提取物灌胃 将造模成功大鼠随机分为AD模型对照组、西药治疗组、通天草水提物高剂量组、通天草水提物低剂量组、通天草醇提物高剂量组和通天草醇提物低剂量组,另设阴性对照组、假手术组,每组各12只。阴性对照组、假手术组和AD模型对照组:灌胃等体积生理盐水。各组大鼠在造模后第7 d开始灌胃给药,每日1次,连续21 d。

2.3 行为学观察 现在检测大鼠记忆力的Morris水迷宫的指标有很多,其中最常用的评价指标是定位航行实验的“逃避潜伏期”[6]。在水池内装入纯净自来水,加适量黑色素隐蔽站台。实验时将水池均分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限区,在第Ⅲ象限中放置1个没于水下1 cm的站台(站台的区域为E区)。前6 d,每天每只大鼠从4个象限各自固定入水点入水进行训练1次,记录60 s内大鼠从入水到爬上平台所需时间,即逃避潜伏期,共6 d。第7天,撤去站台,进行空间探索试验,将大鼠从第Ⅰ象限入水点放人水池,记录120 s内大鼠在池中游泳路径及在E区游泳穿越次数,作为评价大鼠学习成绩的指标。

2.4 标本制备 水迷宫试验结束后2 d,每组大鼠取6只,经心脏灌注0.9%生理盐水250 mL,然后用4%多聚甲醛200 mL缓慢灌注,至动物尸体展开,肢体变硬为止。开颅快速取出完整大脑,固定于上述灌注液中,4℃冰箱保存,用于病理学和免疫组化检测。

2.5 免疫组织化学检测 1)脑组织固定、脱水、透明、包埋及切片,常规脱蜡到水;2)用3%H2O2室温孵育10 min,再用PBS冲洗5 min,重复3次,以阻断内源性过氧化物酶;3)热修复抗原:将切片浸入枸椽酸盐缓冲液(TBS,pH6.0)中,放于微波炉高火加热至沸腾5 min后,保温10 min,再加热5 min,最后自然冷却至室温,PBS冲洗3次,每次5 min;4)加入一抗(NF-κ Bp65 1∶50;Iκ B-α 1∶50;GFAP 1∶100;S100β 1∶80),4 ℃冰箱里放置过夜,用PBS缓冲液替代特异的一抗杂交液为阴性对照。PBS冲洗3次,每次5 min;5)加入二抗:向载玻片上滴加二抗,37℃恒温箱孵育30 min。PBS洗涤5 min×3次;6)DAB溶液显色:向载玻片中滴加DAB显色剂,室温显色,镜下控制反应时间约5～30 min;7)复染及封片:苏木素中复染1 min,清水冲洗返蓝,然后用梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片后观察。

2.6 结果分析 采用Motic 3000显微摄影系统于400倍下拍照,每组随机选取8张切片,每张切片在海马CA1-CA3区随机摄取3个完全不重叠的视野,采用Motic image advanced 3.2病理图像分析软件进行组化分析,并计数阳性细胞数。阳性表达为淡黄色或棕黄色。

2.7 统计学处理 统计结果以( x±s)表示。应用SPSS 13.0统计分析软件包,先进行单因素方差分析,多组之间比较采用SNK-Q检验,进行相关性分析。P<0.05视为具有统计学意义。

3 结果

3.1 通天草提取物对AD大鼠学习记忆能力的影响结果见表1。

表1 通天草提取物对AD大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数的影响(n=10, x±s)

3.2 通天草提取物对AD大鼠海马区组织相关蛋白 表达的影响 结果见表2。

表2 各组大鼠海马区相关蛋白表达(n=8, x±s)

4 讨论

Morris水迷宫试验是目前判断动物空间学习记忆能力的重要试验方法,该方法规避了跳台法和避暗法造成动物防御性反射逼迫学习的缺点,减少了动物因惊恐心理而对实验结果的影响。[7]

本研究根据β-淀粉样蛋白级联假说[8],建立Aβ1-40所致AD大鼠模型,利用Morris水迷宫实验,结果发现通天草提取物能明显改善Aβ1-40所致AD模型大鼠学习记忆障碍。利用免疫组织化学对脑组织切片中的β-淀粉样蛋白(Aβ),进行原位定性、定位或定量研究,系统地探讨了通天草提取物对Aβ1-40所致AD模型大鼠治疗作用及可能机制。结果发现通天草提取物可显著降低AD模型大鼠Aβ表达,改善Aβ沉积所造成的神经元病理形态学损害,减轻脑中炎性反应,同时通天草提取物能调节海马区神经元中NF-κ B/Iκ B蛋白表达和抑制海马区星形胶质细胞中GFAP和S100β蛋白过度表达。

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[4]李宝龙,单毓娟,刘旭,等.通天草提取物对阿尔茨海默病大鼠脑氧化性损伤的保护作用[J].中医药信息,2012,29(4):24-27.

[5]钟华,杨傲然,范吉平.中医药抗氧化损伤防治阿尔茨海默病[J].长春中医药大学学报,2007,23(5):99-100.

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