欣舒药物血清对原代培养平滑肌细胞增殖的影响*

杨 莺 吴凤兰

（1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.解放军96101部队机关卫生所，辽宁 沈阳 110033）

近年来，经皮腔内冠状动脉介入术（PCI）已成为治疗冠心病的主要手段之一，但术后再狭窄（RS）已成为影响冠心病彻底治疗和PCI后长期效果的主要障碍。VSMC增殖是PCI术后RS形成的关键环节。VSMC增殖是PCI术后新生内膜的主要组成成分，是导致PCI术后RS形成机制的主要病因之一。本实验探讨中药欣舒注射液对VSMC增殖、细胞周期的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 新西兰大耳白兔，4周龄，雄性，体质量0.5 kg，购自辽宁中医药大学实验动物中心。作细胞培养用。

1.2 试剂 试剂1：20%FBS（FBS购自天津灏洋生物制品有限公司），DMEM，高糖，双抗，Hepes，NaHCO3。试剂 2：10%FBS，DMEM，高糖，双抗，Hepes，NaHCO3。试 剂 3：0.01 mol，pH 7.4，PBS 配 制 ：NaCL 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g， 用双蒸水依次溶解、添加，最后使总量为1000 mL，pH为7.4，高压，4℃保存。试剂4：消化液配制：用PBS配制，4℃过夜，溶解。Tripsin（胰酶）：0.25/100 mL，EDTA 0.04/100 mL。

1.3 含药血清制备

1.3.1 动物 健康新西兰大耳白兔48只，月龄6～8个月，体质量（2.5±0.5）kg，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。作药物血清制备用。

1.3.2 药物 中药欣舒注射液，由人参、麦冬、川芎组成，每 1 mL含总皂苷以人参皂苷Re（C48H82O18）计，不得少于0.80 mg；阿托伐他汀，北京嘉林药业股份有限公司，批准文号：国药准字H19990258。

1.3.3 分组与造模 随机分正常组、模型组、欣舒注射液组（简称中药组）、阿托伐他汀组（简称西药组），每组12只。除正常组外，其余3组行手术造模。用20%乌拉坦溶液以5 mL/kg腹腔麻醉家兔，于右侧腹股沟部进行脱毛消毒。切开皮肤，分离右股动脉，穿刺右股动脉，逆行导入直径2.5或3.0 mm的球囊导管（依血管直径而定）至肾动脉下方，盐水充盈球囊（压力为4～6 atm），缓慢回拉导管至切口处，抽空球囊内液体，使压力降至零，重复上述过程，反复3次，达到剥脱动脉内皮的目的。然后撤出导管，结扎股动脉，缝合皮肤。

1.3.4 给药方法 正常组动物未经手术及用药；模型组术前、术后未用药；中药组动物于术前1 d开始给予欣舒注射液［4 mL/（kg·d）］，耳缘静脉缓慢注射，连续用药15 d；西药组动物于术前1 d开始给予阿托伐他汀片［ mg/（kg·d）］口服，连续用药 15 d。

1.3.5 标本采集与检测 造模2周，正常组动物、中药组动物、西药组动物腹腔麻醉后，腹主动脉取血，分离血清，-70℃冰箱保存备用。使用时于37℃下溶化后，过0.22 μm滤膜过滤除菌。

2 方 法

2.1 原代平滑肌细胞培养

2.1.1 贴壁组织块培养 实验动物采用（细胞培养）气栓法处死，放在5‰新洁尔灭托盘中，固定在木板上。移入超净台内，剪开皮肤，腹膜右移内脏，露出胸腹主动脉，自心脏的主动脉弓下至肾脏处剪断。放入装有试剂3的无菌平皿中清洗2次，除去外膜，清洗摘净。移入试剂1的无菌平皿中剪成小块。吸管吸出，放细胞培养瓶中，将细胞分散粘贴在一次性培养瓶壁上，倒放，下面加入5～6 mL试剂1，轻轻放入CO2温箱内。1 h后培养瓶翻转静置培养。2～3 d后观察。

2.1.2 传代细胞培养 细胞接种3 d后，贴壁的细胞呈放射形伸展，部分区域已融合生长，培养基的pH偏酸，需立即换新鲜培养基，以去掉没有贴壁的细胞及破碎的细胞。6～7 d后，细胞长成单层和多层交错的致密细胞层，即可传代。传代时，倾去原有液体，加试剂3清洗细胞面，然后倾去清洗液，再加试剂4浸泡30 s至1 min，当镜下可观察到细胞成片地收缩时，立即倾去消化液，加入试剂2，用弯头滴管将细胞自瓶壁上吹打下来，以1∶2分装接种。5 d后可再传代。

2.2 血管平滑肌细胞的鉴定 血管平滑肌肌动蛋白（α-SMactin）免疫组织化学鉴定：α-SMactin一抗购自武汉博士德试剂公司。采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）法，检测VSMC的 α-SMactin，以VSMC胞浆棕黄色为阳性结果。

2.3 平滑肌细胞增殖抑制实验

2.3.1 MTT比色法 取传至3代的细胞，用试剂4消化后，以试剂2将细胞稀释至3×104／mL，将细胞接种于96孔培养板中，培养24 h。倒置显微镜下观察待细胞长成次融合状态后，随后将2块96孔板分为A.中药血清组、B.西药血清组，A、B两组均设空白对照组、平滑肌细胞组，平滑肌细胞+正常兔血清组，中药血清和西药血清分别用试剂 2 按 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512 比例稀释，每组 8 个复孔，每孔液体总体积为100 μL，将96孔板于5%CO2、37℃下培养 24 h。以 PBS溶解 MTT制成 5 mg／mL溶液，20 μL／孔。细胞继续培养4 h后取出培养板，倾去培养液，每孔加入150 μL DMSO，并于平板振荡机上振荡10 min，使深蓝色结晶彻底溶解。用酶标测试仪在570 nm为检测波长，630 nm为参考波长处检测吸光度值（OD值）。

2.3.2 流式细胞仪检测细胞生长周期 取3代生长状况良好的VSMC，用试剂4消化后，以试剂2将细胞稀释至3×104／mL，将细胞接种于3块6孔培养板中，培养24～48 h，倒置显微镜下观察待细胞长成次融合状态时，以试剂2继续培养24 h，将3块6孔培养板分为正常兔血清组（简称正常组）、25%中药血清组（简称中药组）、25%西药血清组（简称西药组），每组1块培养板，每组6个复孔，每孔液体总体积为3 mL，分别培养24 h后，收集细胞，流式细胞仪测定细胞DNA含量，观察细胞周期变化情况。

2.4 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件。均数间经方差齐性检验后，数值以（）表示，以单因素方差分析统计结果。

3 结 果

3.1 血管平滑肌细胞的鉴定 显微镜下观察可见细胞的胞浆呈棕黄色，并且含有与细胞纵轴平行排列的肌丝。

3.2 MTT比色法测定 欣舒注射液对VSMC增殖的影响以细胞+25%药物血清组对平滑肌细胞增殖的抑制最强，因此，采用25%浓度药物血清进行流式细胞检测。

3.3 流式结果 中药组和西药组G0/G1期细胞数目的百分比高于正常组（P<0.05）；中药组S期、G2/M期细胞数目的百分比低于正常组 （P<0.05）；西药组G2/M期细胞数目的百分比低于正常组 （P<0.05）。中药组G2/M期细胞数目的百分比高于西药组（P<0.05）。

4 讨 论

血管成形术后24～72 h血管平滑肌细胞即开始增殖，7～14 d后达最高峰，约可持续1～2个月。在增生的内膜中，血管平滑肌细胞约占总细胞的88.8%，依其增殖发生过程可将增殖期分为以下4个阶段：中膜平滑肌细胞的增殖，平滑肌细胞内膜下迁移和增殖，相对平衡期，再增殖期。这种再度增殖一般发生在PTCA术1个月以后，2～3个月达高峰，并可持续6个月至1年，直至发生再狭窄。这是PTCA术后最危险的时期［1］。

表1 各组兔平滑肌细胞增殖比较（）

表1 各组兔平滑肌细胞增殖比较（）

与细胞组比较，*P＜0.05；与细胞+正常兔血清组比较，△P＜0.05；与细胞+25%药物血清比较，#P＜0.05。

表2 各组兔平滑肌细胞细胞周期比较（%，）

表2 各组兔平滑肌细胞细胞周期比较（%，）

与正常组比较，*P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。

MTT比色法的基本原理是活细胞的腺粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的甲肟。甲肟形成量与活细胞数及功能状态呈正相关性。因此，可定量测定细胞的存活比例，进而反映药物等因素作用后细胞增殖、存活的情况。

VSMC增殖信号转导最终共同通路是细胞周期。G0/G1是细胞有丝分裂完成到DNA复制前的间期（G1期）与静止（G0期）；S是细胞DNA复制期；G2/M是细胞处于DNA复制完成到有丝分裂开始间期（G2期）和有丝分裂期（M期）。其中有两个主要调控点，G1-S转折点和G2-M转折点，G1-S转折点控制细胞从DNA合成前期（G1期）进入DNA合成期（S期），G2-M转折点为细胞一分为二的控制点。G1-S转折点更为重要，是细胞中很多调节因子及细胞外刺激作用的位点。细胞周期是控制细胞增殖的关键环节，通过对细胞周期的调控，使细胞停滞于G0/G1期来阻断VSMC的增殖可能是防治PCI术后再狭窄的一个有效的途径。

中药欣舒注射液是在益气养阴、活血通络治疗原则指导下组成的中药复方制剂，由人参、麦冬、川芎组成，方中人参大补元气、补脾益肺、生津、安神，麦冬养阴润肺、益胃生津、清心除烦，川芎活血行气、祛风止痛。药理研究表明人参对心脏功能的影响主要是增加心肌收缩力，减慢心率，增加心输出量和冠脉血流量，人参对心肌有保护作用［2］。麦冬注射液给急性实验性心肌缺血犬静脉注射，有改善心脏血流动力学的作用；对实验性心肌梗死犬，有促进心肌损伤愈合和缩小梗死范围及坏死区域的作用［2］。川芎嗪对血管内皮细胞有保护作用，可抑制血管平滑肌细胞增殖［3］，诸药合用，共奏益气养阴﹑活血通络之功。益气养阴以鼓动血行，促使血流通畅，气血调和，瘀血行散而气机通畅，标实为血瘀，当活血通络。

本实验提示中药欣舒注射液可能通过调控细胞周期G1-S、G2-M转折点，进而抑制VSMC的增殖。

［1］高炜，霍勇，朱国英，等.再狭窄的细胞和分子生物学［J］.中国介入心脏病学杂志，1997，5（2）：85-89.

［2］马清钧，王淑玲.临床实用中药学［M］.江西：江西科学技术出版社，2002：120.

［3］田代华.实用中药辞典［M］.北京：人民卫生出版社，2002：9.