浆细胞性乳腺炎患者外周血CD4+CD25+CD127－调节性T细胞变化①

付 嘉 熊 斌 司传平 方艳秋 谭 岩 李继斌

(济宁医学院免疫教研室，济宁272067)

浆细胞性乳腺炎(Plasma cell mastitis，PCM)是一种非感染性良性乳腺炎症［1］。PCM的病因至今不完全明了，更多的病理学的证据表明在PCM病灶局部浸润大量浆细胞、淋巴细胞、吞噬脂肪的泡沫细胞等［1，2］，提示机体自身免疫应答在该病的进展中发挥重要作用。资料显示CD4+CD25+Foxp3+调节性 T细胞 (CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell，Treg)数量减少或功能异常与多种自身免疫病相关［3-5］，但对于 PCM 患者 CD4+CD25+Foxp3+Treg是否有变化国内外未见报道。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究PCM患者共58例，年龄25～59岁，平均为(38.6±6.2)岁，均为经产妇、非哺乳期妇女。术前细针穿刺细胞学检查及术后冰冻切片检查确认为PCM。按照Hartley的方法根据临床表现将 PCM 分为三期［8］:① 急性组 13例(22%):伴有乳房肿块12例，乳头溢液5例，乳腺疼痛10例，乳头内陷 6例;②亚急性组 25例(43%):伴有乳房肿块23例，乳腺疼痛15例，乳头溢液13例，乳头内陷9例，乳腺瘘形成4例;③慢性组20例(34%):伴有乳房肿块15例，乳头溢液12例，乳腺疼痛8例，乳头内陷15例，乳腺瘘形成9例，橘皮样外观10例，淋巴结肿大9例，见表1。

1.2 主要仪器与试剂 流式细胞仪FACSCalibur(BD公司);抗人 PE-Cy5-anti-CD4、Alexa Fluor488-anti-CD25、PE-anti-CD127及同型对照(均为 eBioscience)、TRIZOL(Invitrogen)，第一链cDNA合成试剂盒和 Oligo(dT)引物(均为 Fermentas);SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo);实时荧光定量PCR检测仪 ABI Prism 7900(Applied Biosystems);人TGF-β检测试剂盒(eBioscience)。

1.3 方法

1.3.1 人CD4+CD25+CD127-Treg细胞的检测无菌取人抗凝静脉血，肝素抗凝。取100 μl全血，分别加入抗人PE-Cy5-anti-CD4、Alexa Fluor488-anti-CD25、PE-anti-CD127 各5 μl，另设同型对照管，补偿管，短时涡旋后4℃避光孵育20～30分钟，加入红细胞裂解液2 ml，短时涡旋后室温孵育15分钟。以2 ml PBS 1 000 r/min离心洗涤5分钟，弃上清，将细胞悬浮于0.5 ml PBS洗涤液中，振荡混匀后上机检测，圈定淋巴细胞为R1门内细胞，CD4+细胞为R2门内细胞，测定CD25+CD127-细胞占 CD4+细胞的百分率。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测人PBMC中Foxp3表达 引物设计:Foxp3引物P1:5'-GTGGCATCATCCGACAAGG-3'和 P2:5'-TGTGGAGGAACTCTGGGAAT-3'，GAPDH 引物 P3:5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'和 P4:5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。用Trizol试剂提取人PBMC总mRNA，用DNaseⅠ去除痕量DNA，分光光度计检测RNA浓度。用第一链cDNA合成试剂盒和Oligo(dT)引物合成Foxp3 cDNA，用SYBR Green PCR Master Mix试剂及ABI Prism 7900荧光定量PCR仪定量检测cDNA。基因的相对表达量用△△CT法。GAPDH作为标准化的内参照，无模板样本作为阴性对照。

1.3.3 ELISA法检测人血浆TGF-β含量 无菌取人抗凝静脉血，肝素抗凝。吸取血浆层冻于-80℃备用。使用人TGF-β检测试剂盒检测血浆TGF-β含量，按照说明书操作。

2 结果

2.1 各进展期PCM患者的临床表现 统计各进展期PCM患者临床表现，其中急性期13例(22%)，亚急性期25例(43%)，慢性期20例(34%)。各期PCM患者都出现乳房肿块、乳房溢液、乳腺疼痛和乳头内陷等症状，亚急性期PCM患者还形成乳腺瘘(4/25)，慢性期患者还出现橘皮样外观和淋巴结肿大等症状(见表1)。

表1 PCM患者在各期的临床表现Tab.1 Clinical manifestation of patients with plasma cell mastitis during three stages

2.2 PCM患者外周血中CD4+CD25+CD127-T细胞百分率变化 流式细胞术检测结果显示，三组PCM患者外周血CD4+CD25+CD127-T细胞在CD4+T细胞中的百分率均较正常组降低(P＜0.05)，其中急性期PCM组下降明显(P＜0.01)。乳腺癌组CD4+CD25+CD127-T细胞百分率与对照组相比，明显升高(P＜0.05)。见图1。

2.3 PCM患者外周血PBMC中转录因子Foxp3表达变化 亚急性组PCM患者外周血PBMC中转录因子Foxp3表达与正常组相比降低(P＜0.05)，急性期PCM组Foxp3表达下降明显(P＜0.01)。乳腺癌组外周血PBMC中转录因子Foxp3表达与对照组相比，明显升高(P＜0.05)。见图2。

2.4 PCM患者血浆TGF-β水平变化 三组PCM患者血浆TGF-β水平与正常组相比均降低(P＜0.05)，其中急性期PCM组血浆TGF-β水平下降明显(P＜0.01)。乳腺癌组血浆TGF-β水平与对照组相比，明显升高(P＜0.05)。见图3。

图1 PCM患者外周血中CD4+CD25+CD127－T细胞百分率变化Fig.1 Detection of CD4+CD25+CD127－cells in acute PCM，subacute PCM and chronic PCM

图2 PCM患者外周血Foxp3 mRNA的表达Fig.2 Foxp3 mRNA expression in patients with PCM

图3 PCM患者血浆TGF-β水平Fig.3 TGF-β concentration in plasma from patients with PCM

3 讨论

调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)可根据来源不同分为自然 Treg(nTreg)和适应性 Treg(iTreg)。nTreg在胸腺中分化、成熟，主要来源于CD4+CD25-胸腺细胞，在CD4+T细胞的自然选择过程中生成并获得CD4+CD25+Foxp3+表型。iTreg来自于外周的CD4+T细胞，包括三个亚群:Tr1、Th3和 Foxp3+表型 iTreg［7］。CD4+CD25+Treg 是调节性T细胞中最受关注的一群，其职能是维持机体自身耐受、控制移植排斥和超敏反应，在感染和肿瘤时抑制效应细胞功能，并防止自身免疫病的发生［9-12］。CD4+CD25+Treg占人和小鼠外周血CD4+T细胞的5% ～10%，除高表达CD25(IL-2受体α链)外，还表达 CD127-、CD45RBlow、GITR、CTLA-4、LAG-3、CCR4、CCR7、CD62Lhigh及 neuropilin-1 等表面分子［7］。叉头/翼状螺旋转录因子 Foxp3(Forkhead/winged helix transcription factor)对CD4+CD25+Treg细胞在胸腺内发育和功能维持是必需的［13］。而Treg的另一个重要标志CD127-(IL-7Ra-)常被用于区别于效应性 CD4+T 细胞及其分离［6，7］。CD4+CD25+Treg的靶细胞涉及 CD4+CD25-T细胞、CD8+T细胞、B细胞、单核细胞和DC，其作用于靶细胞的方式有:分泌抑制性细胞因子TGF-β1、IL-35和IL-10;细胞-细胞直接接触的溶细胞作用;干扰靶细胞代谢;调节DC的成熟及功能［7］。

浆细胞性乳腺炎(PCM)是一种以非周期性乳房疼痛、乳头溢液、乳头凹陷、乳晕区肿块、非哺乳期乳房脓肿、乳头部瘘管为主要临床表现的炎症样特殊类型乳腺良性疾患，占乳房良性病变的4% ～5%。近年来发病率呈逐年上升趋势［2］。PCM临床表现复杂，故而命名也不尽相同，如乳管周围型乳腺炎、乳管导管扩张症等，有学者认为每种病名仅反映其疾病过程的某一病理阶段。根据Hartley的方法可将PCM分为三期［8］:急性期:具有乳腺急性炎症的表现，可在乳晕周围出现红肿、疼痛，伴轻度发热，全身中毒症状不明显;亚急性期:急性炎症已消退，遗留下硬结或肿块，也可继发感染形成乳腺瘘;慢性期:乳房肿块缩小，可出现乳头内陷，甚至橘皮样改变或淋巴结肿大，脓肿反复发作、破溃或形成窦道，肿块可持续数年不等。PCM病理学证据表明乳腺导管周围出现脂肪坏死及大量浆细胞浸润，淋巴细胞弥漫性浸润，其中以浆细胞浸润更为明显，另有数量不等的泡沫状组织细胞、多核巨细胞和上皮样细胞形成肉芽肿［14］。将PCM患者手术切除的乳腺病灶区组织匀浆接种于BALB/c小鼠，可建立PCM的动物模型［15］。提示PCM是一种自身免疫反应参与的疾病。

由于PCM的临床表现及辅助检查无特异性，故极易误诊，其中1/3病例被误诊为乳腺癌。故而，在对PCM进行鉴别诊断时，排除乳腺癌是很重要的一个方面。研究显示乳腺癌患者CD4+CD25+Treg数量明显升高，参与癌症的进展［16］。为研究在自身免疫病中发挥重要作用的CD4+CD25+Treg是否参与PCM的疾病发生与进展，我们采用流式细胞术检测三组不同进展期PCM患者及乳腺癌对照组患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞百分率;并以荧光定量PCR检测转录因子Foxp3表达，ELISA检测血浆TGF-β含量。结果显示，三组PCM患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg数量、外周血PBMC中Foxp3表达及血浆TGF-β水平均下降(P＜0.05)，其中急性PCM组下降最为明显(P＜0.01)，提示PCM的疾病发生及进展可能涉及Treg功能紊乱及重新分布。结果同时显示与PCM临床症状易发生混淆的乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+CD127-Treg数量、外周血PBMC中Foxp3表达及血浆TGF-β水平均升高(P＜0.05)，与报道一致［16］。本研究显示CD4+CD25+Treg在浆细胞乳腺炎疾病进展中发挥作用，并且对PCM患者CD4+CD25+Treg数量的检测也可为乳腺癌的鉴别诊断提供线索。

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14 左文述.现代乳腺肿瘤学［M］.第2版.济南:山东科技出版社，2006:1395-1397.

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