白念珠菌对树突状细胞Bcl 10和IL-23表达的影响①

胡志德 黄元兰 汪怀周 孙 懿 秦 琴 陈孙孝 邓安梅

(济南军区总医院实验诊断科，济南250031)

抗原递呈细胞上的模式识别受体(PRR)对入侵机体的白念珠菌进行感知是免疫系统启动针对白念珠菌感染的免疫应答的基础［1］。树突状细胞是目前已知的唯一可以活化初始辅助性T细胞(Th细胞)的专职抗原递呈细胞，因而也是连接固有免疫应答和获得性免疫应答的枢纽［2］。树突状细胞上的Dectin-1是参与白念珠菌的免疫感知的PRR之一，其配体是白念珠菌细胞壁的主要成分β-1-3葡聚糖［3，4］。当Dectin-1被配体活化以后，其胞浆部分的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)上的酪氨酸被酪氨酸激酶Syk磷酸化，然后迅速募集下游的半胱天冬酶的募集决定蛋白9(CARD9)、Bcl 10和黏膜相关淋巴瘤转位基因1(MALT1)等分子组成信号转导复合物，最终通过NF-κB启动下游多种炎症因子、细胞因子和趋化因子的表达，并由此开启了针对白念珠菌的免疫应答过程［4-8］。此外，最近的研究也发现Dectin-1的激活还可以通过Raf途径启动多种细胞因子的表达，引发有别于CARD9-Bcl 10-MALT1的生物学效应［9］。深入研究这些特定信号转导通路的活化与生物学效应之间的关系，有助于我们更加全面和深入地了解白念珠菌感染诱发的免疫应答机制。

被白念珠菌活化的树突状细胞通过在感染部位及其附近淋巴结形成局部细胞因子微环境而指导初始辅助性T细胞(Th细胞)的分化［10］。在白念珠菌引发的获得性免疫应答中，各种Th细胞在功能上彼此配合，相互制约，决定了针对白念珠菌的免疫应答的强度、类型和持续时间［3］。目前已知，Th17细胞是免疫系统对抗白念珠菌感染的主要力量之一［11］。在Th17的分化历程中，IL-23的主要作用是维持细胞的扩增与存活［12］。IL-23敲除的小鼠，对白念珠菌感染的抵抗力明显减弱，表明IL-23是免疫系统清除白念珠菌感染不可或缺的力量之一［13］。然而，在白念珠菌活化的树突状细胞中，IL-23的表达是否与Bcl 10有关尚不明确。

在本研究中，我们发现在白念珠菌刺激的树突状细胞中，Bcl 10表达逐渐降低，且同时伴随着IL-23的表达降低。我们的结果初步提示，白念珠菌诱导树突状细胞释放IL-23可能与Bcl 10有关。

1 材料与方法

1.1 白念珠菌的来源与灭活 白念珠菌为第二军医大学长征医院皮肤科真菌实验室惠赠(ATCC编号为H137)，复苏后接种沙保氏培养基，在37℃，5%CO2环境下培养48小时后，挑取菌落于生理盐水洗涤两遍，之后采用生理盐水重悬。调整白念珠菌计数为108ml－1，吸取1 ml悬液，置于无菌EP管中，在100℃沸水中灭活1小时后待用。

1.2 树突状细胞的诱导培养 抽取空腹健康个体外周血10 ml，EDTA-K2抗凝，以淋巴细胞分离液LymphoprepTM(挪威AXIS-SHIELD公司)分离外周血单个核细胞。之后以磁珠分离法分离出CD14+细胞，MACS磁性细胞分选试剂盒购自美国Miltenyi biotech公司。校正CD14+细胞浓度至106ml－1，置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、200 U/ml的 GM-CSF和100 U/ml的 IL-4(均购自英国Peprotec公司)的RPMI1640培养基(美国Gibco公司)中进行培养。并于培养第3、5和7天更换细胞培养液。在培养第7天后，加入MOI为1∶1的热灭活白念珠菌进行刺激，并在刺激后的不同时间点检测Bcl 10以及IL-23的表达状况。

1.3 RT-PCR 利用NCBI的引物设计和特异性检验工具Primer-BLAST进行引物设计，得到的引物序列如表1。

RNA的反转录试剂购自Invitrogen公司，反转录过程参照说明书进行。RT-PCR扩增结果采用2－ΔΔct法表示［14］。

1.4 Western blot 采用超声破碎法收集细胞蛋白，98℃热变性5分钟预后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后进行转膜。鼠抗人Bcl 10抗体和内参GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.5 ELISA IL-23的 ELISA试剂盒购自 eBioscience公司，ELISA检测过程参考说明书进行。

1.6 统计学方法 两组资料的比较采用配对样本t检测，不同时间点检测指标之间的比较采用重复测量资料的方差分析。所有的统计学处理均在SPSS17.0中进行，定义 P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 白念珠菌刺激导致单核源性树突状细胞内Bcl 10表达下调 如图1A所示，定量PCR结果表明在接受白念珠菌刺激后，单核源性树突状细胞内Bcl 10 mRNA的相对表达量逐渐下调(P＜0.01)。在刺激12小时后，其相对表达量仅相当于刺激前的40%左右，差异具有统计学意义(P＜0.01)。相比之下，未经白念珠菌刺激的单核源性树突状细胞内Bcl10 mRNA的表达则相对恒定。Western blot结果表明，Bcl 10在蛋白水平的变化与mRNA基本一致。这些结果表明，持续的白念珠菌刺激可以引起单核源性树突状细胞内Bcl 10表达下调。

表1 RT-PCR的引物Tab.1 Primers for RT-PCR

图1 热灭活白念珠菌刺激导致单核源性树突状细胞内Bcl 10表达下调(n=3)Fig.1 Heat-killed Candida albicans stimulation inhibit Bcl 10 expression in monocyte derived dendritic cells(n=3)

图2 热灭活白念珠菌刺激导致单核源性树突状细胞合成和释放IL-23的动态观察Fig.2 Kinetics analysis of IL-23 produced and released by heat-killed Candida albicans treated monocyte derived dendritic cells

2.2 热灭活白念珠菌刺激导致单核源性树突状细胞合成和释放IL-23的动态观察 我们同时分析了白念珠菌刺激对树突状细胞释放IL-23的影响。RT-PCR法检测发现IL-23 mRNA的表达在白念珠菌刺激后迅速增高，但4小时后mRNA的表达逐渐降低(图2A，P均小于0.05)。ELISA法也发现培养基内IL-23的浓度在6小时以后逐渐进入平台期(图2B，P均小于0.01)，提示树突状细胞释放IL-23的速度在逐渐降低。

3 讨论

本研究分析了Bcl 10这一Dectin-1信号通路中发挥重要作用的分子在白念珠菌活化的树突状细胞的表达变化规律，发现其在热灭活白念珠菌刺激后表达逐渐降低，在刺激4小时以后降低的趋势和幅度更为显著，提示Dectin-1信号通路的激活可能会引发一种反馈调节机制，通过抑制Bcl 10的表达来调节Dectin-1信号的强度。已知Dectin-1信号通路的活化会启动多种炎症因子和趋化因子的表达，对Dectin-1信号通路强度进行的调节在一定程度上可以局限免疫应答的强度、类型和持续时间，以保护机体免遭失控的免疫应答造成的病理损伤。

更重要的是，我们发现IL-23 mRNA的表达也同Bcl 10呈现出相同的变化趋势，即在白念珠菌刺激4小时后逐渐降低。培养基内IL-23浓度在刺激6小时以后进入平台期，提示单核源性树突状细胞释放IL-23的速度在白念珠菌刺激6小时以后已经逐渐减弱。结合以往关于Bcl 10参与Dectin-1信号转导的研究结论，这些结果提示热灭活白念珠菌刺激导致的Bcl 10表达下调，可能是引起IL-23表达逐渐下降的原因。然而，Bcl 10表达下调的机制仍然有待于进一步研究。

动物研究和临床研究都相继证实，免疫系统对白念珠菌的识别依赖于Dectin-1，且Dectin-1信号通路的活化可以启动IL-23的表达，在感染部位形成高水平的 IL-23微环境，促进后续的 Th17反应［3，15-17］。然而，Th17 反应是双刃剑，虽然适时、适量的Th17反应有助于病原体的清除，但是失控的Th17反应则会引起机体的免疫损伤［18，19］。本研究结果初步提示，在热灭活白念珠菌刺激的树突状细胞中，Bcl 10可以调节IL-23的释放。我们推测，Bcl 10调节IL-23的释放可能会最终改变Th17反应的强度，进而达到保护机体免遭免疫损伤的目的。

总之，本研究发现了白念珠菌刺激的单核源性树突状细胞内Bcl 10的表达逐渐下调，这可能是导致IL-23表达下调的原因之一。Bcl 10表达下调可能是免疫系统调节Th17反应强度的机制之一。

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