中药诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究进展

刘庆华，马云飞，罗小静，张 婷

(中南民族大学生命科学学院医学生物研究所，武汉430074)

全球每年约有1700万人死于心血管疾病，因急性心肌梗死和慢性心功能不全而导致的死亡占心血管病死亡率50%以上.

20世纪90年代以来，胚胎干细胞技术的出现和发展，给心血管疾病的治疗带来了突破性的进展，在某些特殊条件下，胚胎干细胞可分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，恢复血流灌注，对心肌缺血和肢体缺血的治疗具有十分重要的意义.但是胚胎干细胞在体外自然分化为心肌细胞的效率很低，如何进一步提高胚胎干细胞源心肌细胞的分化率以确保充足的心肌细胞来源是目前亟需解决的首要问题.

中药具有数千年临床应用的历史，具有广泛的药理作用，包括保护缺血心肌，减少再灌注损伤，调节机体的免疫，抗免疫排斥，抗细胞凋亡，促进蛋白的表达等.与细胞因子和化学诱导剂相比较而言，中药更具有廉价、安全和长效性的特点，本文综述了近年来中药诱导干细胞向心肌细胞分化和调控的研究进展，并探讨了胚胎干细胞向心肌细胞定向分化所亟需解决的关键问题.

1 胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究

ES细胞先是由干细胞分化为中胚层，再分化为心肌前体细胞，最终形成心肌终末细胞(图1).研究者们尝试通过基因重组和转染或各种诱导因子，如TGF-β［1］，BMP，FGF，Wnt［2］和干细胞生长因子，维甲酸，维生素C，5-氮胞苷［3］等诱导干细胞向心肌细胞分化，但在干细胞分化不同时间点加入诱导剂，产生的效应不尽相同，说明分化过程中细胞因子的时程表达对细胞分化方向起着决定性作用，在优化的时间点采用细胞因子组合促进ES细胞的心肌分化被证明较单一因子更为有效.

图1 胚胎干细胞分化为心肌细胞的过程图Fig.1 The process diagram of embryonic stem cells differentiation into myocardial cells

2 中药诱导干细胞定向分化为心肌细胞的研究

2.1 黄芩苷

黄芩苷(baicalin)是从植物黄芩根中提取出来的一种黄酮类化合物对心血管系统有保护作用，可减小心肌缺血再灌注时的心肌梗死区域，移植心肌细胞的凋亡，保护心肌缺血再灌注引起的损伤［4，5］.唐美林等［6］发现黄芩苷能抑制ES细胞的增殖，使细胞之间联系更加密切，促进ES细胞向心肌细胞分化，同时黄芩苷通过调控Wnt/β-catenin信号通路实现促进晚期心肌细胞的分化，特别是工作肌细胞的产生，说明黄芩苷可作为促进心肌细胞分化的诱导剂和心肌细胞移植治疗中的细胞保护剂.

2.2 葛根素

葛根素由葛根提取而成，有保护心肌，抗心律失常，降低血压和脑血管阻力，抗氧化和雌激素样作用［7］等.临床普遍用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、心率失常和高血压等疾病.程颖等［8］发现葛根素能通过PI3K/Akt通路影响EB大小，进而影响ES细胞的分化方向，促进心肌细胞的分化，提高心室样心肌细胞的分化率，通过调节TGF-β和Wnt信号途径促进ES细胞的心肌分化和心室肌特化.

2.3 淫羊藿苷

淫羊藿苷(ICA)能够影响内分泌和心血管系统，具有免疫调节，抗肿瘤等多种中药的生物学活性［9］.朱丹雁等［10］研究了淫羊藿苷对 ES 细胞的诱导作用，发现经 ICA处理48h，多数 ES细胞处于G0/G1期，而少数细胞处于S期，在ES细胞分化为心肌细胞的早期，ICA能提高 ES细胞中cAMP/cGMP的比值，上调内源性NO含量，增加心肌发育依赖性基因的表达.丁玲等［11］继续研究发现在分化的第5～8d给予ICA，能最有效地诱导ES细胞体外分化为心肌细胞.证实ICA能在心肌分化信号源头上增加ROS相关酶的表达，在促心肌分化过程中，ROS及其介导的p38MAPK信号通路发挥重要作用.同时ICA促进ES心肌分化过程中线粒体形成相关蛋白过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活子-1α的表达，提高了心肌特异性蛋白α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白 T 的表达［12］.

2.4 黄芪

黄芪具有抗氧化作用，能刺激骨髓基质细胞的增殖，促进其分泌TNF-α和白细胞介素，黄芪甲苷，黄芪含药血清［13］和黄芪注射液能诱导MSCs分化为心肌细胞，诱导后MSCs表达心肌特异性蛋白结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnI)、心肌特异性基因α-心肌肌球蛋白重链(α-MHC)和β-心肌肌球蛋白重链(β-MHC)增强.

2.5 丹参和丹酚酸B

丹参能够改善心肌供血情况，具有抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成，降血脂并延缓冠状动脉硬化发生等药理学作用.丹参联合(5-aza)［14］和复方丹参滴丸含药血清［15］能诱导干细胞分化为心肌细胞.丹参水溶性成分中最主要的活性成分是丹酚酸B(SalB)，具有抗氧化作用，和一些诱导剂相似.SalB能改善心肌梗塞大鼠的心脏功能，并能使心肌基因表达谱发生改变.陈嘉等［16］研究发现用30mg/L SalB的低糖DMEM培养液培养MSCs 24 h后，能增强NKX2.5和GATA-4mRNA的表达，诱导后分化的第14 d出现α-actin mRNA的表达.SalB联合5-aza对MSCs进行联合诱导24 h，能提供心肌特异性蛋白cTnT的表达，能增强心肌早期分化基因NKX2.5和GATA-4表达［17］，能明显增强 Desmin和 α-actin mRNA表达［18］，说明丹参和SalB对MSCs向心肌细胞分化具有一定诱导和促进作用.

2.6 人参皂苷和三七皂苷

人参皂苷(GS)是从人参的根、茎、叶中提取精制而成，具有抗氧化作用，对缺血心肌有保护作用.人参皂苷Rg1能通过刺激心肌局部组织分泌粒细胞集落刺激因子(G-CSF)而诱导骨髓细胞游走至心肌组织进而向血管内皮细胞分化.三七总皂苷(PNS)是三七提取的活性有效成分.三七皂苷以浓度依赖方式减少 S期细胞，阻滞细胞于 G0/G1期［19］，经 GS/PNS 组，5-aza 组，GS/PNS+5-aza 组诱导后的MSC，心肌样细胞的特异性蛋白结蛋白和肌钙蛋白阳性细胞增多，心肌细胞特征性基因α-MHC和 β-MHC 的表达增强［20，21］.

2.7 双龙方

中药复方双龙方(主要成分人参皂苷Rb1，丹参酚酸B)，具有益气养血，活血通脉之功效，并在治疗心肌梗塞上有显著作用.有研究小组利用基因芯片技术［22］和二维电泳分离技术［23］检测双龙方诱导ES细胞分化过程中差异表达的基因和蛋白变化，发现双龙方能诱导ES细胞分化为心肌细胞，其所引起的差异基因变化与5-aza相似.综上不同中药的药理作用和研究进展汇总见表1.

表1 不同中药的药理作用和研究进展Fig.1 Pharmacological effects and the research progresses of different of traditional Chinese medicine(TCM)

3 中药诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞存在的问题及前景

随着ES细胞的建系和培养技术，ES细胞自我更新和定向分化的调控机制方面有了更深入的研究.如何充分利用ES细胞分化的心肌细胞，更清楚地了解心肌分化的机制，多能干细胞的临床应用和干细胞移植仍然面临许多问题需要解决:1)明确诱导心肌分化的信号调控机制，寻找合适的诱导条件使ES细胞有效地分化为心肌细胞;2)控制合适的移植心肌细胞的数目和迁移定位;3)保证移植后细胞的存活率和增殖状态;4)促使移植后的心肌细胞在电生理上与受体组织协调一致，安全长效的发挥正常生理作用［24，25］.

对ES细胞移植治疗心肌梗死而言，若能发现有效促进心肌分化的中药，将大大提高治疗效果，其原因如下:1)选择临床运用广泛的中药，促进干细胞分化为足量健康的心肌细胞，同时配合移植治疗心脏疾病;2)中药能为体外培养的心肌细胞提供良好的培养环境，利于心肌细胞生长;3)中药可直接刺激自体干细胞本身分泌调控因子，启动心肌分化程序;4)中药与其他药物配合，相互作用，能提高诱导效率，高效微量，毒副作用少.

［1］Watabe T，Miyazono K.Roles of TGF-beta family signaling in stem cell renewal and differentiation［J］.Cell Res，2009，19(1):103-115.

［2］Nakamura T，Sano M，Songyang Z，et al.A Wnt-and betacatein-dependent pathway for mammalian cardiac myogeneses［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA，2003，100(1):5834-5839.

［3］Wang Y，Chen G，Song T，et al.Enhancement of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells［J］.Sci China Life Sci，2010，53(1):581-589.

［4］Chang W T，Shao Z H，Yin J J，et al.Comparatative effects of flavonoids on oxidant scavenging and ischemia-reperfusion injury in cardiomyocytes［J］.Eur J Pharmacol，2007，566(1):59-66.

［5］Lin L，Wu X D，Davey A K，et al.The anti-inflammatory effect of baicalin on hupoxia/reoxygenation and TNF-alpha induces injury in cultural rat cardiomyocytes［J］.Phytother Res，2010，24(1):429-437.

［6］唐美林.黄芩苷促进小鼠胚胎干细胞向功能性心肌细胞分化及其调控机制［D］.武汉:华中科技大学，2012.

［7］Malaixijitnond S，Tungmunnithum D，Gittarasanee S，et al.Puerarin exhibits weak estrogenic activity in female rats［J］.Fitoterapia，2010，81(1):569-576.

［8］程 颖.葛根素促进小鼠胚胎干细胞源工作心肌细胞的分化及其调控机制［D］.武汉:华中科技大学，2011.

［9］刘雪花.淫羊藿苷药理研究进展［J］.中国现代医生，2009，21(1):49-50.

［10］Zhu D Y，Lou Y J.Inducible effects of icariin，icaritin and desmethylicaritin on directional differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，26(4):477-485.

［11］Ding L，Liang X G，Hu Y，et al.Involvement of p38MAPK and reactive oxygen species in icariin-induced cardiomyocyte differentiation of murine embryonic stem cells in vitro［J］.Stem Cells Dev，2008，17(4):751-760.

［12］Ding L，Liang X G，Zhu D Y，et al.Icariin promotes expression of PGC-1 alpha，PPARalpha，and NRF-1 during cardiomyocyte differentiation of murine embryonic stem cells in vitro［J］.Acta Pharmocol Sin，2007，28(10):1541-1549.

［13］杨庆有，冼绍祥，孙慧茹，等.黄芪含药血清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究［J］.辽宁中医杂志，2008，35(6):832-834.

［14］王芳洁，易岂建，郭鹏飞.小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验［J］.第四军医大学学报，2009，9(1):808-811.

［15］武重阳，孙兰军，赵英强，等.复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞［J］.中国老年学杂志，2010，16(1):2328-2330.

［16］陈 嘉，孙京臣，邹移海，等.丹酚酸b诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化［J］.第四军医大学学报，2007，23(1):2152-2155.

［17］孙连胜，徐秀梅，郭茂娟，等.丹酚酸B体外干预骨髓间充质干细胞分化过程中cTnT的表达［J］.天津中医药，2007，4(1):49-51.

［18］华声瑜，赵桂峰，郭茂娟，等.丹酚酸B在大鼠骨髓间充质干细胞分化过程对心肌早期基因Nkx2.5 GATA-4 mRNA表达的影响［J］.辽宁中医杂志，2008，8(1):409-412.

［19］庞荣清，潘吴覃.三七总皂苷对兔血管平滑肌细胞核因子 κappaB 和细胞周期的影响［J］.中国微循环，2004，3(1):154-156.

［20］汪朝晖，冼绍祥，杨忠奇，等.人参总皂苷诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究［J］.广州中医药大学学报，2006，2(1):100-103.

［21］李志泉，冼绍祥，汪朝晖，等.三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响［J］.广州中医药大学学报，2007，6(1):470-475.

［22］王金津，钱夕元，李 雪，等.双龙方有效成分诱导干细胞分化过程中差异表达基因的筛选和聚类分析［J］.世界科学技术-中医药现代化，2007，3(1):39-42.

［23］Fan X，Li X，Lü S，et al.Comparative proteomics research on ratMSCsdifferentiation induced by Shuanglong Formula［J］.J Ethnopharmacol，2010，131(3):575-580.

［24］Menasche P.Stem cell therapy for heart failure:are arrhythmias a real safety concern?［J］.Circulation，2009，119(20):2735-2740.

［25］Segers V F，Lee R T.Stem cell therapy for cardiac disease［J］.Nature，2008，451(7181):937-942.