人体消化道高抗逆性双歧杆菌的筛选

郭德军，纪振杰，张平，张洪薇，张丽萍，王长远，唐彦军，肖念平

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

双歧杆菌（Bifidobacteria）是一种人体肠道共生菌，作为一种重要的益生菌，现广泛用于乳品发酵，用以缓解和治疗肠道紊乱。双歧杆菌对人体健康具有多种有益的作用，包括调整肠道微生物菌群，抑制多种病原微生物的生长，提高免疫力等[1-2]。双歧杆菌最初是从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到的，是一种革兰氏阳性、厌氧、不运动的分枝杆菌[1]；新分离到的菌株多呈Y 和V 型、刀状或棒状，继代培养后，由于培养基或培养条件的不适合，它常呈现为直或曲棒状、分枝状[3]。双歧杆菌是人体肠道的微生态调节剂，其自身的耐酸、耐胆汁盐及肠道黏附能力，是其能否发挥益生作用的关键因素[4-7]，经人工胃液、肠液筛选和黏附性测定，筛选人体消化道环境高抗逆性双歧杆菌，为其进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

从贝飞达双歧三联活菌胶囊、思联康口服四联活菌片、丽珠肠乐口服双歧杆菌活菌制剂及大森林康乐片等四种药品和母乳喂养的健康婴儿粪便中分离出的5 株厌氧乳酸菌，经16SrRNA 测序比对鉴定为双歧杆菌，分别命名为A-1、B-1、B-2、L-1、Y-1，现黑龙江八一农垦大学食品学院微生物实验室保藏。

1.1.2 培养基和主要试剂

12%的脱脂乳、改良MRS 培养基、BL 培养基、缓冲蛋白胨水溶液（BP）、pH6.98 PBS 缓冲液、10%牛血清DMEM 细胞培养液、0.1% DAPI；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆酸钠、0.25% 胰酶消化液等试剂，均购于上海生工公司；Caco-2 结肠癌细胞，吉林大学人兽共患病所保藏。

溶液A：以0.01 M pH6.98 的PBS 缓冲液为基础，用体积分数为37%的盐酸将把改良MRS 液体培养基的pH 值调至3.0，115 ℃灭菌15 min。

溶液B：在改良MRS 液体培养基中添加0.03%的牛胆酸钠，115 ℃灭菌15 min。

1.1.3 仪器与设备

厌氧培养箱YQX-II 型，上海新苗医疗器械制造有限公司；激光共聚焦显微镜OLS3000，日本OLYMPUS 公司；二氧化碳培养箱HH·CP 型01A，上海一恒科学仪器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 黏附性的测定

将培养好的结肠癌细胞Caco-2 用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，加入含有无菌盖玻片的24 孔细胞培养板中，每孔1 mL，在二氧化碳培养箱中37 ℃条件下培养，细胞贴壁后，PBS 洗涤三次，每孔加入1/10 培养基体积的DAPI 溶液，37 ℃条件下避光培养10～20 min，使细胞染色。无菌PBS 洗涤两次后，加入0.5 mL 双歧杆菌菌液和0.5 mL 含10%牛血清的EMDM 细胞培养液，37 ℃二氧化碳培养箱中培养2 h，无菌PBS 洗涤两次，加10%甲醛固定10～20 min，无菌PBS 洗涤两次后留加200 μL PBS。将固定好的细胞爬片，盖上盖玻片，在油镜下观察，然后激光共聚焦显微镜观察计数10 个随机视野中20 个细胞上黏附的细菌数，取平均值。

1.2.2 抗逆性菌株的初筛

（1）耐酸试验：在溶液A 中，按10%的接种量接入已活化2 代的双歧杆菌液体培养物，37 ℃厌氧培养2 h，期间每隔30 min 取样，进行梯度稀释，使用BL 平板进行菌落计数，每个梯度重复三次取平均值。

（2）耐胆汁盐试验：在溶液B 中，按3%的接种量接入已活化2 代的双歧杆菌液体培养物，37 ℃厌氧培养24 h 后，样品经梯度稀释，BL 平板进行菌落计数，每个梯度重复三次取平均值。

1.2.3 抗逆性菌株的复筛

（1）菌株对模拟胃液的抗逆性试验

pH 值3.0 的 改 良MRS 培养基，115 ℃灭 菌15 min，无菌添加胃蛋白酶5 mg·mL-1。按10%接种量接入初筛抗逆性较高菌株的培养液。37 ℃厌氧培养，分别于0、30、60、90 和120 min 取样测其活菌数，以此判断其对胃液的抗逆性。

存活率=不同时间的活菌数的平均值/0 min 时活菌数的平均值

（2）菌株对模拟肠液的抗逆性试验

pH 值6.9 改良MRS 培养基，并分别加入的0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.2% 牛胆酸钠，115 ℃灭菌15 min 后冷却至室温后，添加胰蛋白酶10 mg·mL-1，配置成模拟肠液；将初筛菌株按3%的添加量添加到模拟肠液中，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后测其活菌数，并计算存活率。重复三次取平均值。存活率=24 h 模拟肠液处理后的每组实验活菌数的平均值/0 h 每组实验存活活菌数的平均值。

2 结果分析

2.1 黏附性

五株双歧杆菌对Caco-2 细胞的黏附效果见图1，黏附能力见表1。从表中可以看出，这五株双歧杆菌对Caco-2 细胞的均有黏附作用，黏附能力略有差异，五株菌的黏附能力大小依次为Y-1＞B-1＞L-1＞A-1＞B-2。

2.2 初筛后的结果

（1）耐酸试验

五株双歧杆菌在pH3.0 的A 液中作用120 min的结果见图2，从图中可以看出，这五株菌对酸均有一定的耐受能力，耐受性最弱的是菌株是B-2 和A-1，在培养120 min 后存活率分别为46.3%、56.7%；而菌株Y-1、B-1、L-1 在120 min 后存活率仍为93%、95.5%、86%，其中菌株B-1 耐酸能力最强。

图1 五株双歧杆菌菌对Caco-2 细胞的黏附效果图（10×100）Fig.1 Adhesive capability of five bifidobacterium strains on human colon cancer Caco-2 cells

表1 五株双歧杆菌对Caco-2 细胞的黏附结果Table 1 Adhesion results of five bifidobacterium strains on human colon cancer Caco-2 cells

图2 pH3.0 条件对5 个菌株存活率的影响Fig.2 Effect of pH3.0 on survival rate of different strains

（2）耐胆汁盐试验

五株双歧杆菌抗牛胆酸盐筛选结果见图3，从图中可以看出，这五株菌对牛胆汁盐均有一定的耐受能力，但是A-1 的耐受性最弱，24 h 后活菌数为＜106cfu·mL-1，L-1 的耐受性最强，24 h 后活菌数为＞107cfu·mL-1。

图3 胆汁酸盐浓度为0.3 g·kg-1 时对五株菌生长的影响（培养24 h）Fig.3 Effect of 0.3 g·kg-1 bile concentration on survivability of different strains

考虑到双歧活菌产品服用时，活菌是先到胃再到肠道，所以优良菌株必须对这两种环境都有较高的耐受性，因此根据上述5 种菌初筛结果，选定B-1、L-1、Y-1 三株菌进行复筛。

2.3 复筛后的结果

（1）菌株对模拟胃液的抗逆性

菌株B-1、L-1、Y-1 在模拟胃液中作用2 h。其存活率结果见图4。试验菌株在模拟胃液中作用2 h 后，其存活率均大约70%；Y-1 在胃液中的抗逆性最强，其活菌数下降速度较其他两株菌缓慢，在120 min 后其存活率约达76%。

图4 模拟胃液对不同菌株生长的影响Fig.4 Effect of simulated gastric fluid on survivability of different strains

（2）菌株对模拟肠液的抗逆性

菌株B-1、L-1、Y-1 在模拟肠液中作用24 h，其活菌数结果见图5。在含有不同质量浓度的胆汁盐的模拟肠液对这三株双歧杆菌均有不同程度的抑制作用，随着胆汁盐浓度增加，抑制作用随之增强，但不同菌体对胆汁盐抗性存在明显差异。在0.01%～0.03%的胆汁盐浓度培养24 h 后，试验菌株活菌数尽管比对照有所降低，但是比培养前均有一定增长。在0.05%和0.20%胆汁盐浓度时，试验菌株活菌数均有不同程度的下降；其中L-1 的抗逆性最好，在胆汁盐浓度为0.2%的模拟肠液时24 h 后，其存活率为14%，其活菌数仍＞106cfu·mL-1。

图5 模拟肠液对不同双歧菌株生长的影响Fig.5 Effect of simulated intestinal fluid on growth of different

3 讨论

双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌具有多种益生功能[6]，其中黏附是其肠道定植的关键一步，只有具有高黏附能力的菌株才能较多的定植于肠道，更好的发挥其生理活性，五株双歧杆菌的黏附能力依次为Y-1＞B-1＞L-1＞A-1＞B-2，但它们的黏附数差异较小。使用激光共聚焦显微镜能清楚地观察到双歧杆菌黏附在Caco-2 的表面及边缘上，且黏附后的Caco-2 细胞表面的结构未被破坏。在实验中发现，在不使用DAPI 对Caco-2 细胞染色，同样也能获得较好的黏附观察效果。目前，对双歧杆菌在肠道细胞上黏附机理的研究普遍认为，双歧杆菌是通过一种叫作黏附素的物质而黏附到肠道细胞上的，是双歧杆菌的黏附素与肠道细胞相应受体之间的特异性结合过程，肠道细胞是否具有相应的受体及受体的类型决定着双歧杆菌是否在特定的部位黏附[7-8]。

活菌能否顺利通过胃酸关，其酸耐受能力是又一个关键因素。胃液pH 因饮食结构不同而波动很大，通常约为pH3.0 左右，空腹或食用酸性食品时可达到pH1.5，食用碱性食品时可达pH4.0～5.0；食物在胃中停留的时间通常为1～2 h，所以实验选择pH3.0，作用时间2 h 作为初筛标准；除了胃酸对菌体存活有影响外，肠道中的胆汁盐能改变菌体外膜的通透性，对双歧杆菌产生抑制和杀灭作用，进而影响双歧杆菌的存活；已知不同来源的双歧杆菌因胆盐脱氢酶活性不同，对胆盐有着不同的耐受性，人体小肠中含有胆汁酸盐浓度一般在0.03%～0.3%，一般将0.03%胆汁酸盐质量浓度作为筛选耐胆汁酸盐菌体的标准，实验也发现0.01%和0.02%胆汁酸盐质量浓度对双歧杆菌活菌数的影响很小，当达到0.03%时，不同菌株抗胆盐能力出现明显差异，高浓度胆汁盐时差异更加明显。初筛获得抗逆性菌株再经过模拟胃液和模拟肠液进行胃肠道抗逆性复筛，在模拟胃液中120 min 菌株Y-1 存活率最高，约为76%，L-1 约为72%；但是在模拟肠液在菌株Y-1 的在不同质量浓度的胆汁酸盐的浓度存活率最弱的，Y-1 在胆汁盐浓度为0.2%时，24 h 后其活菌数＜104cfu·mL-1，存活率为0.08%；而L-1＞106cfu·mL-1，存活率为14%；L-1 在模拟胃液的存活率与模拟肠液的存活率乘积远远大于Y-1 乘积。因此，选择抗逆性最好的L-1 菌株作为进一步应用的基础菌株。

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