猪日本乙型脑炎病毒NS1基因的表达和抗体制备

沈红霞，韩秀杰，赵凡凡，张保新，余风艳，王晓杜

(浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300)

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，又称日本脑炎病毒，可引起以中枢神经系统损害为主的虫媒性人畜共患病，即乙型脑炎或日本脑炎。中国乙脑发病人数占世界总发病数的80%以上[1]。JEV可以感染蚊子Culicidae和猪Sus scrofa domesticus，作为JEV的寄存宿主，猪感染乙脑病毒后表现为繁殖机能障碍，母猪表现为产死胎、木乃伊胎等。该病不仅严重影响养猪业的健康发展，也是兽医公共卫生重点关注的疾病之一。JEV属黄病毒科Flaviviridae黄病毒属Flavivirus，其基因组为单股、正链RNA分子，其长度约为11 kb(10 976 bp)，从5′端96位ATG起始，至3′端10 393位终止，仅形成1个长约10.3 kb的开放读码框架 (ORF)，编码1个长为3 432个氨基酸残基的蛋白前体，在宿主细胞内蛋白酶和病毒蛋白酶的切割下，它产生3种结构蛋白(C蛋白、PrM/M和E蛋白)以及7种非结构蛋白 (NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b 和 NS5)[2－3]。该病毒经过几十年的进化，现存 5 种基因型，整个亚洲JEV的各种基因型都有流行[4]。其中JEV-NS1基因全长约1 245 bp，预测分子量为40 kDa左右，由于N端存在糖基化位点，所以在病毒感染细胞中是分子量为46 kDa的糖蛋白[5]。前体蛋白首先在E-NS1位点裂解后，NS1转位到内质网膜上，然后NS1～NS2a位点发生裂解，产生成熟的NS1[6]。NS1的主要功能是作为病毒RNA复制的共因子，参与病毒RNA的合成。与此同时，因它能分泌到胞外，激发机体产生针对NS1的抗体，而此抗体能抵抗病毒的感染[7]，所以NS1也与E和M蛋白一样，作为疫苗开发的对象得到广泛研究。本研究克隆猪日本乙型脑炎的NS1基因，构建重组原核表达载体，在大肠埃希菌Escherichia coli中大量表达，并纯化该重组蛋白，制备小鼠抗JEV-NS1的抗体，验证抗体的特异性，为探讨该蛋白的功能及病毒复制的相关研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

猪日本乙型脑炎病毒SH-JEV01毒株由中国农业科学院上海兽医研究所马志永研究员惠赠；BHK-21细胞，原核表达载体pET-28(a)、大肠埃希菌感受态细胞DH5α和BL21(DE3)为浙江农林大学兽医微生物学实验室保存。ICR小鼠Mus musculus购于浙江省医科院实验动物中心。

核酸标准(DNA marker DL2000)，限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ，AMV反转录试剂盒，Taq DNA聚合酶等购自大连宝生物公司；T4 DNA ligase购于NEB公司；IPTG和弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购于Sigma公司；Trizol购自invitrogen公司；DNA胶回收试剂盒购于上海华舜生物公司；A型小量DNA片段快速纯化回收试剂盒，质粒DNA小量提取试剂盒购于axgen生物有限公司。其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因组RNA的提取 将JEV病毒感染的BHK-21细胞样品重悬于Trizol试剂中，室温10 min后，加入1/3体积氯仿，反复混匀后室温5 min。以15 000°min－1离心15 min，吸取上清液转移至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，反复混匀后室温沉淀5 min，以15 000°min－1离心15 min。去掉上清液后，用70%的乙醇洗涤沉淀1次，室温干燥后，溶于适量的RNase free水中，－20℃储存备用。

1.2.2 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增JEV-NS1基因 根据AMV反转录试剂盒说明书上的方法，将上面提取的病毒基因组RNA，利用随机引物反转录合成cDNA。以此cDNA为模板，JEV-NS1引物上游 F: 5′gcggaattcatggacactggatgtg 3′； JEV-NS1 全长片段下游引物 R1: 5′gcggtcgacttaggcagcgactagc 3′(1～1 254 bp)，JEV-NS1 突变体下游引物 R2: 5′gcggtcgacttacggaagggagcaactg 3′(1～957 bp)，在 PCR 管中加入如下 20 μL 体系: RNAse Free ddH2O 14.3 μL，10×缓冲液 2.0 μL，dNTPs 1.6 μL，10 μmol°L－1引物各0.4 μL，Taq酶0.3 μL，cDNA模板 1.0 μL；在PCR仪中以下面条件进行PCR扩增: 94℃预变性5 min；94℃变性50 s，58℃退火50 s，72℃延伸2 min，共35个循环；循环结束后72℃延伸10 min，最后4℃保存。10.0g°L－1琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.3 pET-28(a)-JEV-NS1重组质粒构建 将上述胶回收的JEV-NS1的PCR产物和pET-28(a)空质粒使用EcoRⅠ，SalⅠ分别进行双酶切，酶切回收后，回收产物在T4连接酶作用下，把JEV-NS1全长和突变体亚克隆到pET-28(a)载体上，转化大肠埃希菌DH5α，挑取菌落经PCR和重组质粒双酶酶切鉴定为阳性者，送上海英骏生物公司测序鉴定。

1.2.4 重组蛋白JEV-NS1的诱导表达 上述阳性重组质粒pET-28(a)-JEV-NS1和 pET-28(a)-JEV-NS1-mutant转化到大肠埃希菌BL21(DE3)内，挑取克隆扩大培养，细菌生长到对数期时加入1.0mmol°L－1的IPTG诱导，培养3 h后，取样并煮沸制备样品，SDS-PAGE检测重组JEV-NS1和JEV-NS1-mutant蛋白表达情况。

1.2.5 重组蛋白JEV-NS1的纯化 将1.2.4鉴定好的表达JEV-NS1蛋白的阳性克隆扩大到100.0 mL进行培养，当细菌生长到对数期时，加入1.0 mmol°L－1的IPTG，诱导表达3 h后，收集菌体，按照王晓杜等[8]方法提取包涵体，溶解好的包涵体按照his-band Ni＋试剂盒说明书方法进行纯化，纯化后蛋白利用透析的方法进行复性，制备大量可溶性的重组JEV-NS1蛋白。聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该蛋白包涵体提取和纯化效果。

1.2.6 多克隆抗体的制备 将纯化后的JEV-NS1蛋白与弗氏完全佐剂佐剂混合均匀(1:1)，颈部皮下注射给ICR小鼠(50 μg°只－1)，2周后用弗氏不完全佐剂与蛋白混合后注射，以后隔2周注射1次，共免疫4次后采血，收集血清即为多克隆抗体。用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定其效价。

1.2.7 抗体特异性检测 根据王晓杜[9]的方法，分别以原核表达产物和病毒感染后Vero细胞的裂解产物作为上样样品，进行SDS-PAGE，再以制备的小鼠抗JEV-NS1多克隆抗体作为一抗，western-blotting显色，验证抗体的特异性。

2 结果与分析

2.1 JEV-NS1基因RT-PCR结果

以1.2.2合成的JEV cDNA为模板，用带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，RT-PCR扩增JEV-NS1的基因片段，所克隆的片段带有起始密码子ATG和终止密码子TAA。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明(图1)，本研究获得大小1.3 kb左右的片段，与预期大小基本一致。

2.2 重组质粒pET-28(a)-JEV-NS1的构建

用EcoRⅠ和SalⅠ酶分别对JEV-NS1基因的PCR产物、pET-28(a)空载体进行双酶切，酶切产物经纯化试剂盒纯化回收后，JEV-NS1基因的PCR产物、pET-28(a)空载体经T4连接酶连接，连接产物转化大肠埃希菌DH5α，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆，过夜培养后提取质粒，所获得的重组质粒再进一步用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切鉴定，琼脂糖电泳，结果(图2)为阳性的细菌克隆送上海桑尼生物公司测序。测序结果获得的序列，经美国国家生物技术信息中心(NCBI)上Blast比对，该片段与NCBI上公布的JEV-NS1基因序列同源性高达99%(GenBank No:AF315119)，说明本研究克隆到了JEV-NS1基因，并且该序列正确插入到pET-28(a)空载体，重组表达载体pET-28(a)-JEV-NS1构建成功。

2.3 重组JEV-NS1蛋白的诱导表达

上述鉴定好的pET-28(a)-JEV-NS1重组表达质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)，挑取2～3个克隆过夜培养，重新转接培养至对数生长期后，1 mmol°L－1IPTG诱导3 h，在异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导前和诱导后分别取样，加入1×十二烷基磺酸钠(SDS)上样缓冲液，煮沸裂解细菌，SDSPAGE电泳检测重组蛋白表达情况。结果表明:重组蛋白JEV-NS1在大肠埃希菌内大量表达(图3)，利用DNASTAR软件分析，预期分子量大小为(40＋8)kDa，结果表明表达蛋白大小与预期一致(48 kDa左右)。薄层扫描分析表明，表达的重组蛋白占总菌体蛋白的20%以上。利用his-band Ni＋柱纯化，只能得到很少的蛋白，不能用于进行下一步实验。

2.4 JEV-NS1-mutant重组蛋白的表达和纯化

根据网站预测(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)发现JEV-NS1基因序列中大肠埃希菌稀有密码子有20个，特别是从958 bp开始有连续3个稀有密码子，这将限制该基因在大肠埃希菌中的表达，所以重新设计下游引物，按照1.2.3方法构建重组pET-28(a)-JEV-NS1-mutant(958～1 245 bp截短)质粒(图4)。重组pET-28(a)-JEV-NS1-mutant质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测表明(图5)，获得大小为39 kDa左右的重组蛋白(31 kDa＋8 kDa)，JEV-NS1-mutant蛋白表达量明显上升，表达的重组蛋白占总菌体蛋白的40%以上。经his-band Ni＋纯化，获得高纯度的重组JEV-NS1-mutant蛋白，占纯化后总蛋白的85%以上。

图1 JEV-NS1基因的RT-PCR扩增结果Figure 1 Amplification of JEVNS1 by RT-PCR

图2 pET-28(a)-JEV-NS1 重组质粒的酶切鉴定Figure 2 Digestion ofrecombinant plasmid pET-28 (a)-JEVNS1 by restrict enzyme

图3 重组JEV-NS1蛋白的诱导表达Figure 3 Expression of recombinant protein JEV-NS1 by IPTG induction

图4 pET-28(a)-JEV-NS1-mutant重组质粒的构建Figure 4 Construction of recombinant plasmid pET-28(a)-JEV-NS1-mutant

图5 重组JEV-NS1-mutant蛋白的诱导表达和纯化Figure 5 Expression and purification of recombinant protein JEV-NS1-mutant by IPTG induction

2.5 JEV-NS1免疫原性及抗体特异性鉴定

重组JEV-NS1-mutant蛋白免疫ICR小鼠，制备的小鼠抗JEV-NS1多克隆抗体，其ELISA效价为2×105。以原核表达产物(JEV-NS1，JEV-NS1-mutant)进行SDS-PAGE，小鼠抗JEV-NS1作为一抗，westernblotting检测抗体与抗原的反应性，结果表明:抗体能特异的识别JEV-NS1蛋白和JEV-NS1-mutant蛋白，证明该蛋白具有较好的免疫原性(图6A)。病毒感染vero细胞12，24，36，48 h后，收取细胞样品，裂解后进行SDS-PAGE，以本研究制备的小鼠抗JEV-NS1抗体作为一抗，western-blotting检测抗体与病毒表达JEV-NS1蛋白的反应性，结果表明小鼠抗JEV-NS1抗体能特异识别病毒表达的NS1蛋白(图6B)。

3 讨论

JEV病毒的NS1蛋白在黄病毒科家族中具有较高的保守性，它能激发机体产生中和抗体，是JEV亚单位疫苗的候选者，其DNA疫苗具有较好的免疫保护能力[10]。有较多的学者利用各种不同的表达系统表达该蛋白，一方面可以研究NS1在致病机制中的作用[7]，另一方面可以建立检测JEV感染的方法[11]。由于抗NS1抗体能通过Fc受体依赖的途径引发机体的保护性免疫[12]，所以开发出针对NS1的许多单克隆抗体用于治疗JEV和黄病毒科病毒的感染[13]。

本研究克隆了从猪群中分离的神经毒JEV病毒株的NS1基因，该序列与美国国家生物技术信息中心上公布序列同源性99%以上，在原核表达系统中大量表达重组蛋白JEV-NS1，表达量达到菌体总蛋白的20%以上，表达量偏低。由于JEV-NS1基因的958 bp后有连续3个稀有密码子，所以通过突变截短该基因，使得重组蛋白表达量得到极大提高，经纯化后达总蛋白的85%以上。利用高纯度的重组JEV-NS1-mutant蛋白免疫IRC小鼠，制备了小鼠抗JEV-NS1抗体，抗体效价水平较高，特异性也较好，为检测JEV试剂盒的建立提供工具，也为研究其病毒诱导的细胞免疫中的作用和探讨其在病毒致病中的机理打下较好的基础。JEV引起的母猪繁殖障碍给养猪业带来了重大危害，该病在猪群中的发生具有重要的公共卫生学意义，因此，监测该病的流行情况，控制它在猪群中的扩散，研发抗病毒药物等措施都有利于该病的防控。

图6 JEV-NS1抗原性和小鼠抗JEV-NS1抗体特异性验证Figure 6 Immunogenicity of JEV-NS1 and the specificity of mouse anti-JEV-NS1 antibody

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