糖尿病心肌病小鼠心肌成纤维细胞miR-375表达及其对胶原蛋白Ⅰ合成的影响

黄燕，张赢予，王好，周艳芳，张国辉，芮涛

(江苏大学附属人民医院心内科，江苏镇江212002)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的常见并发症，其临床诊断是基于糖尿病患者独立于冠心病、高血压和乙醇性心肌病等出现心功能不全［1］。心肌纤维化是糖尿病心肌病发生发展过程中共同的、标志性的病理特征。心肌纤维化主要是心肌成纤维细胞合成细胞外基质蛋白增加，如Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)，Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)［2］。微小RNA(microRNA)是由18～24个核苷酸组成的非编码的小分子RNA，通过与靶mRNA的3'-UTR区域的互补配对结合而抑制靶mRNA的翻译或促进该mRNA的降解从而降低目标蛋白的表达，进而发挥其生物学功能［3］。以往研究表明，miR-375直接调节胰腺β细胞胰岛素的分泌，其表达与糖尿病的形成密切相关［4］。本研究旨在检测糖尿病状态下心肌成纤维细胞中miR-375的表达，同时探讨miR-375在糖尿病心肌纤维化中的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物和主要试剂

C57BL/6小鼠，2～4周龄，雌雄不限，由江苏大学动物实验中心提供。DMEM(高糖及低糖)购自美国Gibco公司;标准小牛血清购自美国Hyclone公司，胰酶购自美国Sigma公司;细胞RNA提取试剂盒，RNA反转录试剂盒，实时荧光定量 PCR试剂盒，小鼠 miR-375引物，RNU6B购自QIAGEN公司;小鼠miR375抑制剂(荧光素标记)购自上海吉玛制药技术有限公司;转染试剂，无血清培养基购自Invitrogen公司;免疫组化试剂盒购自北京厚德生物科技有限公司;波形蛋白(vimentin)一抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌成纤维细胞的分离、培养及传代脱颈法处死C57BL/6小鼠，75%乙醇消毒2次，无菌条件下取出心脏，将其剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，用无Ca2+-Mg2+的Hank's缓冲液清洗组织块，0.08%胰酶加0.06%胶原酶37℃水浴消化，收集消化后的上清并用含20%血清的低糖(5 mmol/L)DMEM中和，直至组织块变透明终止消化。将收集的细胞离心重悬，接种至10 cm2细胞培养皿，37℃ 5%CO2培养箱内培养2 h，差速贴壁法除去未贴壁的其他细胞，用含10%小牛血清的低糖DMEM培养基培养心肌成纤维细胞。当细胞长满至培养皿的70%～80%时，用0.25%胰酶消化按1∶2的比例进行传代。

1.2.2 心肌成纤维细胞形态学观察及鉴定 倒置显微镜下观察第2代心肌成纤维细胞的形态。取第2代的心肌成纤维细胞采用免疫组化法进行波形蛋白鉴定，波形蛋白阳性率作为心肌成纤维细胞纯度鉴定的指标，阴性对照用PBS代替一抗。400倍显微镜下随机选取5个视野计数20～30个细胞，计算波形蛋白阳性细胞的比例。

1.2.3 实时定量PCR检测心肌成纤维细胞中miR-375的表达 心肌成纤维细胞分为2组，即对照组和高糖处理组，对照组采用5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养，高糖处理组采用25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养。利用细胞RNA提取试剂盒提取总RNA，DEPC水溶解获得的RNA，核酸蛋白分析仪(Beckman Coulter，USA)检测 RNA浓度及纯度;RNA反转录试剂盒将细胞总RNA反转录成cDNA;构建miR-375和RNU6B的实时定量PCR反应体系(20 μL):实时定量PCR 混合试剂10 μL、通用引物2 μL、去核糖核酸酶水 4 μL、小鼠 miR-375 引物2 μL、cDNA 模板2 μL;反应条件:95 ℃变性15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共 40 个循环，每个样本均作复管PCR反应，至少重复2次(实时定量PCR仪采用Bio-rad CFX96)。采用RNU6B作为内参照，用RNU6B的拷贝数作为校正基数，通过Light Cycler软件直接获得各个样本中miR-375的ΔCt值;以对照组的 ΔCt值作为校正，得出 － ΔΔCt，按目的基因表达量 =2－ΔΔCt公式计算各个样本中miR-375的相对表达量。

1.2.4 miR-375抑制剂转染心肌成纤维细胞 在37℃、5%CO2孵育箱中，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培养心肌成纤维细胞。转染前以胰酶消化心肌成纤维细胞，计数后，以105/mL接种于6孔板中，待细胞的融合率达到80%左右时，换为不含血清的高糖DMEM培养液，饥饿细胞6 h，按照说明书转染细胞，阴性对照组转染miR-375抑制剂阴性对照。转染6 h后，换为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，培养48 h后采用实时定量PCR方法检测细胞转染效率。

1.2.5 免疫组化检测各组心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达 心肌成纤维细胞按105/mL接种于置有无菌盖玻片的6孔板内进行细胞爬片，细胞贴壁后，用高糖培养基处理6 h，瞬时转染miR-375抑制剂;转染48 h后采用免疫组化试剂盒检测Ⅰ型胶原蛋白的表达。操作步骤:PBS漂洗，3%H2O2-甲醛处理，PBS漂洗，血清封闭，一抗(1∶200，PBS稀释)孵育过夜，PBS漂洗，二抗孵育，PBS漂洗，SABC孵育，PBS漂洗，DAB显色，自来水冲洗，苏木青复染，自来水冲洗，脱水、透明、封片、镜检。阴性对照用PBS代替一抗。200倍显微镜下随机选取5个视野，每个视野计数20～30个细胞，计算Ⅰ型胶原蛋白阳性细胞的比例。

1.3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据采用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞形态学观察及纯度鉴定

在倒置显微镜下观察，心肌成纤维细胞呈梭形，多角形，细胞质透明，细胞核大，呈椭圆形，常含有2～3个核。培养第2代的心肌成纤维细胞波形蛋白鉴定，心肌成纤维细胞胞质呈棕黄色，即表达阳性，非心肌成纤维细胞表达阴性，结果显示心肌成纤维细胞纯度达90%。见图1。

图1 免疫组化染色鉴定心肌成纤维细胞纯度(×400)Fig 1 The purity of cardiac fibroblasts evaluated by immunohistochemical staining with vimentin

2.2 高糖对心肌成纤维细胞中miR-375表达的影响

实时定量PCR方法检测结果显示，心肌成纤维细胞经高糖处理6，12，24 h后，miR-375表达增加(F=91.263，P＜0.05)，均显著高于对照组(P均＜0.05)，见图2。

图2 实时定量PCR检测miR-375的差异性表达Fig 2 The different expression of miR-375 in cardiac fibroblasts detected by qRT-PCR

2.3 miR-375抑制剂的转染效率

荧光实时定量PCR检测结果显示，miR-375抑制剂转染心肌成纤维细胞的效率约70%，见图3。心肌成纤维细胞转染48 h后用于实验。

图3 实时定量PCR检测miR-375抑制剂转染效率Fig 3 The transfection efficiency of miR-375 inhibitor detected by qRT-PCR

2.4 miR-37抑制剂对高糖处理心肌成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

免疫组化Ⅰ型胶原蛋白阳性心肌成纤维细胞胞质呈棕褐色。Ⅰ型胶原蛋白阳性率=Ⅰ型胶原蛋白阳性细胞数/总细胞数×100%。免疫组化结果表明，miR-375抑制剂组的心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白阳性表达率(37.84±3.34)%显著低于miR-375抑制剂阴性对照组的(76.20±6.96)%，差异有统计学意义(t=5.346，P ＜0.05)。见图4。

图4 免疫组化染色检测心肌成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白的表达(×200)Fig 4 Expression of collagenⅠin cardiac fibroblasts evaluated by immunohistochemical staining

3 讨论

糖尿病心肌病是糖尿病的常见并发症之一，也是导致糖尿病患者致残率和致死率较高的主要原因。其发病机制至今未明，对该病的治疗仍缺乏有效手段。心肌纤维化是糖尿病心肌病的病理性改变之一。心肌纤维化是心肌成纤维细胞合成细胞外基质蛋白，如Ⅰ型胶原蛋白﹑Ⅲ型胶原蛋白等增加，进而在心肌细胞间隙沉积，导致心室壁僵硬，顺应性下降，影响心室的舒张和收缩功能，最终导致心力衰竭，甚至死亡。近年来，在探索心肌纤维化发生机制的过程中，微小RNA的作用引人关注。微小RNA是一类非编码的小分子RNA，通过与靶mRNA特异性以碱基互补配对的方式结合，促进靶mRNA的降解或抑制该mRNA的翻译而发挥其生物学功能［3］。微小RNA在许多生物学过程中发挥重要的调控作用，如细胞增殖、分化、凋亡、癌症发生等。最近研究表明，微小RNA也参与调控心血管系统的发育和疾病发生过程。目前已经证明miR-133和miR-30通过靶向作用于结缔组织生长因子，一种关键的促纤维化蛋白，而参与心肌纤维化的形成［5］。另外，也已证明在冠状动脉结扎的心肌梗死小鼠模型中miR-29的表达下降与胶原蛋白的表达增加相关，所以被认为参与心肌纤维化［6］。Feng等［7］发现糖尿病心肌 miR-133表达下降导致糖尿病小鼠心肌肥厚。

本课题组前期通过微阵基因序列检测分析，发现糖尿病小鼠的心肌有多个微小RNA的表达上调，其中包括 miR-375，miR-99a，miR-133a等。miR-375最初被发现在胰腺胰岛中表达，调节胰岛素的分泌和葡萄糖的代谢［8］，影响胰腺α和β细胞的质量并参与胰腺癌的发展［8－10］。最近报道 miR-375与肿瘤的发展有关，其在一些恶性肿瘤中表达下调如肝癌、胃 癌［11－13］，头 颈 部 鳞 状 细 胞 癌［14－15］、胰 腺癌［16］。但到目前为止，miR-375调节糖尿病心肌纤维化相关的蛋白表达，参与糖尿病心肌纤维化的发生和发展尚未见文献报道。

本实验通过体外培养C57BL/6小鼠的心肌成纤维细胞经高糖处理制成DCM模型，发现心肌成纤维细胞经高糖处理6，12，24 h后，miR-375的表达均显著增加，这一研究结果表明糖尿病高血糖影响心肌成纤维细胞miR-375的表达;另外，高糖处理的心肌成纤维细胞在转染miR-375抑制剂抑制miR-375表达后，胞质中Ⅰ型胶原蛋白的表达显著降低，这提示，miR-375在糖尿病心肌纤维化中起一定的作用，其具体的作用机制尚不清楚。基于生物信息工具，miR-375靶向作用于IL-33的3'-UTR，而新近研究报道IL-33具有抗纤维化的作用。因此，我们推测miR-375可能通过靶向作用于IL-33参与糖尿病心肌纤维化的发生发展。为研究miR-375在糖尿病心肌病心肌纤维化中的确切机制，需明确高血糖是否能导致心肌成纤维细胞IL-33的表达下调从而促进心肌纤维化的发生，以及IL-33mRNA 3-UTR是否为miR-375的靶标。

本研究结果提示miR-375在糖尿病心肌纤维化中起一定的作用，为探讨糖尿病心肌病心肌纤维化发病机制提供了新的线索，对糖尿病心肌病心肌纤维化的治疗提供了新的理论依据。

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