S100B在多柔比星诱导心肌细胞损伤中的表达及作用

韩尧辉，潘皓，毛俊倩，周艳芳，张赢予，王好，鲍永辉，赵龙，刘玲玲，张国辉

(江苏大学附属人民医院心内科，江苏镇江212002)

多柔比星(doxorubicin，DOX)是一种广谱抗肿瘤药物，长期应用可引起心脏毒性，进而引起不可逆转的心肌损伤和心功能障碍［1］。研究表明多柔比星引起的心脏毒性与心肌细胞的凋亡密切相关。S100B作为一种多功能钙敏感蛋白，在生理条件下，心肌细胞几乎不表达。有研究表明S100B可以直接引起心肌细胞凋亡［2］。本实验通过建立多柔比星损伤心肌细胞模型，研究S100B在心肌细胞损伤时的表达变化;通过RNA干扰技术沉默S100B基因，研究S100B在多柔比星诱导心肌细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1日龄新生SD大鼠，雌雄不限，由江苏大学实验动物中心提供。S100B siRNA:上游序列5'-CCGGGAACUAUUGAUAAGATT-3'，下游序列 5'-UCUUAUCAAUAGUUCCCGGTT-3';阴性对照siRNA:上游序列5'-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游序列5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'皆由上海吉玛公司合成。脂质体RNAi-MAX购自美国Invitrogen公司。盐酸多柔比星购自美国Enzo公司，DMEMF-12培养基、MTT均购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司，多聚赖氨酸、RIPA裂解液(强)、PMSF均购自碧云天生物科技公司，α-横纹肌肌动蛋白(αsarcomericactin，α-SA)、链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒购自南京厚载生物科技有限公司，S100B(D10G6)兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling，单克隆β-肌动蛋白购自北京四正柏生物科技有限公司，山羊抗兔、抗小鼠IgG、免疫印迹高灵敏度化学发光检测试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司。其余生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞原代培养 取出生1 d的SD乳鼠，75%的乙醇消毒2次，无菌条件下开胸取出心脏，置于预冷的PBS中吹打清洗2次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，加入5倍体积0.08%的胰酶于37℃水浴箱振荡消化5 min，收集除第1次外的细胞悬液，置于含20%胎牛血清的DMEMF-12培养基中终止消化。重复上述过程，直至组织块完全消化，最后离心、重悬、200目滤网过滤、接种，置于37℃、5%CO2孵育箱中培养1.5 h，纯化心肌细胞。按密度为1×106接种在6孔板中，孵育箱中静置培养，待用。

1.2.2 心肌细胞形态学观察及鉴定 于倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态学变化及搏动情况并拍照;培养72 h的心肌细胞，PBS清洗3次，4%的低聚甲醛固定后，用α-SA做免疫组化进行纯度鉴定，镜下随机取20个视野，每个视野20个细胞，计算心肌细胞比例。

1.2.3 分组及转染 体外分离培养心肌细胞，选取生长状态好的随机分为4组:对照组为正常心肌细胞，不做任何处理;DOX组:加入2 μmol/L多柔比星处理2 h;DNC组:转染阴性siRNA，加入多柔比星(2 μmol/L)处理2 h;DSB组:转染特异性 S100B-siRNA，加入多柔比星(2 μmol/L)处理 2 h。按照Invitrogen脂质体RNAi-MAX说明，转染前24 h换用无血清DMEMF-12培养基，于细胞融合度为80%时进行转染。取100 μL DMEMF-12稀释5 μL siRNA，轻轻混匀，100 μL DMEMF-12 与6 μL 的脂质体RNAi-MAX轻轻混匀，最后将两者混合物等体积混匀，轻柔吹打几次，室温孵育15 min。将200 μL的混合液呈滴状滴加在6孔板中，混匀。最终siRNA浓度为100 nmol/L。置37℃、5%CO2孵箱中培养24 h后，换含有10%胎牛血清的DMEMF-12培养基继续培养24 h，弃掉培养液，DOX组、DNC组和DSB组分别加入终浓度为2 μmol/L的多柔比星处理2 h。

1.2.4 MTT检测细胞存活率 心肌细胞按1×105接种于96孔板中，待细胞融合度达80%时，按上述方法进行转染，以不做任何处理的心肌细胞作为对照组，每组设4个复孔，空白孔调零。每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃ 孵育 4 h，弃每孔上清，加150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪(490 nm)检测各孔光密度(D)值。心肌细胞存活率=(处理组D值-空白孔D值)/(对照组D值-空白孔D值)×100%。

1.2.5 流式细胞术检测凋亡率 将处理后的心肌细胞用胰酶消化、离心收集。预冷的PBS洗涤细胞2次，结合缓冲液重新悬浮细胞，调整密度为1×106/mL;取100 μL的细胞悬液加入5 μL的Annexin V-FITC，轻轻混匀后于4℃避光孵育15 min;再加10 μL PI轻轻混匀于4℃避光孵育5 min;最后加入300 μL的结合缓冲液，在1 h内流式细胞仪检测，以百分数表示凋亡率。

1.2.6 蛋白质印迹检测S100B蛋白 处理后的心肌细胞用预冷的PBS清洗3次，细胞刮刮取细胞，4℃，5 000 r/min，离心5 min，收集细胞团，加入RIPA裂解液(含 PMSF)冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，离心20 min，收集上清液即为总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液100℃变性5 min，上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样约为40 μg，电泳结束后将蛋白印迹到硝酸纤维膜上，5%的脱脂奶粉封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，最后ECL显影。采用Image-proplus软件分析蛋白条带D值，以靶蛋白D值与β-肌动蛋白D值的比值反应靶蛋白相对水平。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理和分析，计量资料以±s表示，多组数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞形态学观察及纯度鉴定

刚分离的心肌细胞呈球形，培养4 h细胞开始贴壁生长，逐渐由圆形变为梭形，并开始伸出伪足，后变为三角形、多边形等。培养72 h后细胞伸出伪足相互交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，搏动呈同步性，搏动频率为65～150次/min，见图1。培养72 h的心肌细胞进行α-SA鉴定，细胞质呈棕黄色即为阳性，结果显示心肌细胞纯度可达90%。见图2。

图1 倒置显微镜下观察培养后的心肌细胞(×200)Fig 1 Cultured cardiomyocytes isolated from 1d SD rats

图2 α-SA免疫化学染色鉴定原代心肌细胞纯度(×400)Fig 2 Purity of cardiomyocytes evaluated by immunocytochemical staining with α-SA

2.2 各组心肌细胞存活率比较

MTT检测结果表明，DNC组心肌细胞存活率与DOX组相比差异无统计学意义(P＞0.05);与DOX组相比，DSB组存活率上升，差异有统计学意义(t=2.48，P ＜0.05)。见表1。

2.3 各组心肌细胞凋亡率比较

流式细胞术分析表明，DNC组心肌细胞凋亡率与DOX组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);与DOX组相比，DSB组凋亡率降低(t=0.76，P＜0.01)，差异有统计学意义。见图3，表1。

2.4 各组心肌细胞S100B蛋白表达

蛋白质印迹法检测S100B蛋白表达结果显示，DNC组与DOX组相比差异无统计学意义(P＞0.05);与DOX组相比，DSB组蛋白表达明显降低(t=1.82，P ＜0.01)。见图4，5。

图3 流式细胞术检测心肌细胞凋亡率Fig 3 Apoptosis rate determined by flow cytometry

表1 各组心肌细胞存活率和凋亡率Tab 1 Survival rate and apoptosis rate of cardiomyocytes from different groups

图4 蛋白质印迹检测心肌细胞S100B蛋白表达Fig 4 The results of S100B protein expression evaluated by Western blotting

图5 各组心肌细胞S100B表达比较Fig 5 S100B protein expression in different groups

3 讨论

多柔比星是一种蒽环类抗肿瘤抗生素，广泛应用于多种肿瘤性疾病的治疗，由于该药存在心脏毒性并呈现剂量依赖性［3］，从而限制了其临床应用。目前，对于多柔比星心脏毒性的机制仍不明确，普遍认为，活性氧自由基、线粒体损伤、钙超载、脂质过氧化、心肌细胞凋亡为其重要环节，随着进一步的研究，多柔比星导致的心肌细胞凋亡成为新的研究热点［4］。研究发现，心肌细胞的凋亡是多柔比星心脏毒性最为直接的表现形式之一［5］。多柔比星诱导的心肌细胞凋亡的具体机制目前主要集中在Fas/FasL途径、线粒体途径、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、p53途径等。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞主动死亡形式。细胞外部的因素，可通过影响这些基因的表达，实现对凋亡的调控。在多柔比星引起的心脏毒性中，细胞凋亡发挥着极为重要的作用，光镜下观察发现，多柔比星处理过的心肌组织存在着大量凋亡的细胞。S100B是S100蛋白家族的一员，是一种新型的钙敏感结合蛋白，在正常的心肌细胞中不表达［6］。近几年通过转基因技术研究发现，S100B的过度表达能够引起心肌细胞凋亡，导致心梗小鼠梗死面积扩大［2］。在培养的心肌细胞中，加入外源性的S100B可以引起心肌细胞凋亡，并呈剂量依赖性，起始剂量为 100 nmol/L［7］。S100B有可能是与晚期糖基化终末产物受体(RAGE)相互作用进而激活 ERK1/2和 p53［7］，导致细胞色素C释放以及激活了预凋亡胱天蛋白酶级联反应(已经在N18神经母细胞瘤细胞中证实)［8］，从而引起心肌细胞凋亡。此外，在细胞内S100B也有可能通过激活诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和产生一氧化氮(NO)，从而调节心肌细胞凋亡［9］，这一现象已经在星形细胞中证实［10］。

本实验建立多柔比星损伤模型，观察S100B蛋白的表达变化及其作用。结果表明，S100B在正常心肌细胞中不表达，多柔比星诱导凋亡的心肌细胞中表达明显增加;多柔比星干预后的心肌细胞存活率降低，凋亡率升高。用脂质体RNAi-MAX转染试剂介导化学合成的siRNA转染原代大鼠心肌细胞后，与DOX组相比，DSB组心肌细胞凋亡率降低，S100B蛋白表达明显受到抑制。这说明S100B在多柔比星诱导心肌细胞凋亡中起促进作用。

综上所述，S100B可能是多柔比星诱导心肌细胞凋亡的重要途径之一，可作为对多柔比星心脏毒性进一步探索的靶点。

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