硫脲壳聚糖-银配合物的制备及其结构和抑菌性能研究

康武魁，孙新枝

(青岛农业大学 化学与药学院，山东 青岛 266109)

壳聚糖(CTS)及其衍生物对植物病原真菌的孢子萌发和菌丝生长均有阻碍作用[1-4]，壳聚糖不仅对植物无毒，而且还能诱导寄主植物的种子、果实和叶片增强抗病性，从而减轻真菌病害的发生[5-6]. 朱晓红[7]发现壳聚糖铜能增强对某些植物病原菌的抑制作用. 吴慧清[8]发现合成后的壳聚糖锌配合物比原来的壳聚糖溶解度增加了，对细菌的抑菌效果增强了，但对真菌抑菌性能比常规化学型防腐剂差一些. 冯小强[9]讨论了水溶性壳聚糖和壳聚糖Fe(III)配合物对E.coli和St.aureus均有显著的抑菌性能.

对壳聚糖进行改性可以达到增强其抑菌活性的目的. 硫脲壳聚糖(TU-CTS)，由于其分子结构中含有大量带孤对电子的活性基团，与多种金属离子形成金属配合物，在废水处理、环境监测等应用领域有诱人的前景，同时金属离子具有抗炎、杀菌、抗凝血等作用[10]. 将这两种有生物活性的物质通过配位反应得到一种新型的目标化合物，期望该化合物能发挥协同效应. 作者合成了硫脲壳聚糖-Ag配合物，采用红外光谱对其结构进行分析，并对其抑菌活性进行了研究.

1 实验部分

1.1 材料与试剂

壳聚糖(CTS，脱乙酰度 92.5%)浙江玉环海洋生物化学有限公司；苹果腐烂病菌(Valsa mali)、苹果轮纹病菌(Botyosphaeria berengeriana)、苹果斑点落叶菌(Alternaria mali Roberts)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、葡萄白腐菌(Coniothyrium Diplodiella)均由青岛农业大学化学与药学院提供. 硫脲、硝酸银、HAc、乙醇、丙酮等其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

IR200型傅立叶变换红外光谱仪，美国Thermo公司；AA-6800原子吸收分光光度计，日本 Shimadzu公司.

1.3 实验方法

1.3.1 硫脲壳聚糖(TU-CTS)的制备[11]

将0.05 mol的硫脲和0.1 mol的壳聚糖(CTS)加入到100 mL无水乙醇中，搅拌回流12～16 h，产物冷却至室温，过滤，滤饼经无水乙醇洗涤后溶于500 mL体积分数1%的HAc溶液，溶解均匀后，在快速搅拌下缓慢加入约150 mL 10% NaOH溶液中，沉淀，过滤，用蒸馏水洗至中性，40 ℃干燥，得硫脲壳聚糖.

1.3.2 硫脲壳聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)的制备[11]

将0.5 g硫脲壳聚糖(TU-CTS)溶于50 mL 体积分数为1%的HAc溶液中. 分别将10 mL含有0.001 g(TUCTS-Ag-1)，0.005 g(TUCTS-Ag-2)，0.01 g(TUCTS-Ag-3)，0.02 g AgNO3(TUCTS-Ag-4)的溶液缓慢滴入50 mL溶解均匀的硫脲壳聚糖HAc溶液中，同时用黑色物品将烧瓶遮光防止Ag+被还原，室温下搅拌反应3～5 h后，200 mL丙酮沉淀，95%乙醇多次淋洗沉淀，过滤，用 NaCl溶液检验滤液中是否有Ag+残留至无AgCl沉淀产生. 40 ℃干燥，得到不同银含量的硫脲壳聚糖-Ag配合物. 用原子吸收分光光度计测定Ag+质量分数. 在硫脲壳聚糖-Ag配合物中的Ag+含量分别为0.18 mg/g、0.82 mg/g、1.44 mg/g和2.32 mg/g.

1.3.3 硫脲壳聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)对细菌的抑菌性能

将大肠杆菌和金黄葡萄球菌用营养琼脂试管斜面(15 g琼脂，10 g蛋白胨，3 g牛肉膏，3 g食盐溶于1 L水中)进行活化后，取一环于生理盐水中充分震荡制成菌悬液，通过平板计数法[12]，确定菌悬液的稀释度，使菌悬液所含活菌量为1×105～1×106CFU / mL.

用体积分数为1% HAc溶液配制质量浓度为5 g/L的TUCTS-Ag-1、TUCTS-Ag-2、TUCTS-Ag-3、TUCTS-Ag-4、TU-CTS和CTS 溶液，对照组为体积分数1%的HAc溶液. 取直径6 mm已灭菌的圆滤纸片充分浸泡在溶液中1 h. 取0.1 mL菌悬液均匀涂布在培养基平板上，然后用无菌镊子夹取浸泡过样品的圆滤纸片贴于培养皿中，每皿贴1片. 平行测定5组. 37 ℃恒温培养24～48 h，测定抑菌圈直径.

1.3.4 菌丝生长速率法测定硫脲壳聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)对真菌的抑菌性能

将真菌接种于马铃薯培养基(PDA)，27 ℃下活化长满培养皿，在菌落边缘菌丝生长旺盛处用打孔器打取直径为0.5 cm的菌饼，备用. 将一定浓度不同的样品与PDA混合，使样品的最终浓度分别为0.5、0.25、0.1和0.05 g/L，以相应浓度的HAc溶液作为空白对照，121 ℃高压灭菌15 min后倒平板，冷却后分别接种于每个培养皿中央( 有菌丝的一面向下). 每个培养皿放一个菌饼，每个处理设 5个重复，27 ℃ 培养箱中培养一定时间后，采用十字交叉法测定菌落直径. 按以下公式计算抑菌率：

×100%

1.3.5 结构表征

采用KBr 压片法，扫描波数范围为400～4 000 cm-1，测定壳聚糖、硫脲壳聚糖及硫脲壳聚糖-Ag配合物的红外光谱；原子吸收分光光度计，火焰法，Ag灯测定.

2 结果与讨论

2.1 硫脲壳聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)的红外表征

由图1可知，壳聚糖、硫脲壳聚糖及硫脲壳聚糖-Ag配合物的红外吸收光谱大体上相似，三者的主要成分均为壳聚糖. 壳聚糖中位于3 446 cm-1左右的N-H、O-H缔合峰形，改性后发生位移且峰形变窄；壳聚糖原位于1 664cm-1处较强的酰胺吸收峰和1 600cm-1左右的-NH2面内弯曲振动吸收峰，在硫脲壳聚糖中分别位移至1 638和1 616 cm-1处；硫脲壳聚糖在1 493 cm-1处出现一弱的新峰，表明在壳聚糖结构中的-NH2上引入硫脲基团[13]. 与TU-CTS相比，TUCTS-Ag配合物的红外光谱在613、825.4 cm-1出现新的吸收峰[14]，归属为S-Ag伸缩振动峰.

2.2 抑菌活性

图1 壳聚糖(a)、硫脲壳聚糖(b)和硫脲壳聚糖-Ag配合物(c)的红外光谱Fig.1 IR spectra of (a)CTS,(b)TU-CTS and (c)TUCTS-Ag

2.2.1 硫脲壳聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)对细菌的抑菌活性

如表1所示，壳聚糖，硫脲壳聚糖，硫脲壳聚糖-Ag配合物对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抑菌圈直径均大于7 mm，说明有抑菌效果. 硫脲壳聚糖的抑菌圈直径比壳聚糖的小，可能是硫脲壳聚糖中自由氨基减少，能够形成的阳离子减少，抑菌效果降低. 4种硫脲壳聚糖-Ag配合物的抑菌圈直径远远大于壳聚糖和硫脲壳聚糖的抑菌圈直径，说明硫脲壳聚糖-Ag配合物的抑菌效果很好. TUCTS-Ag-1、TUCTS-Ag-2、TUCTS-Ag-3和TUCTS-Ag-4因不同配合物中银含量的不同，其抑菌效果不同；随着TUCTS-Ag中银含量的增大，抑菌效果明显增强. 这说明配合物中银的存在对抑菌有明显的作用，还有壳聚糖中游离氨基形成的阳离子正电荷起到协同作用.

2.2.2 硫脲壳聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)对真菌的抑菌作用

通过菌丝生长速率法测定不同样品对不同真菌的抑菌性能，计算抑菌率，结果如表2和表3所示.

由表2可以看出，壳聚糖、硫脲壳聚糖和硫脲壳聚糖-Ag配合物对所测5种植物病原菌均有效果，除了壳聚糖对番茄灰霉菌无抑制. 硫脲壳聚糖相对壳聚糖，抑菌率明显提高，说明在壳聚糖分子结构中引入的硫脲基团有一定的抑菌性能. 与壳聚糖和硫脲壳聚糖的抑菌效果相比，硫脲壳聚糖-Ag配合物对病原菌的抑菌效果更好，由此说明 Ag+已成功配位到硫脲壳聚糖结构中，且由于银本身具有很强的杀菌抑菌性能，加入极少量的Ag+(0.09 mg/L)，对苹果腐烂菌和葡萄白腐菌的抑菌率高达82.54%和84.13%.

样品浓度的不同对抑菌率的影响是非常显著的，如表3所示. 不同的样品因浓度的改变，抑菌率的变化规律基本一致. 对葡萄白腐菌，4个样品的不同浓度溶液的抑菌率均超过70%，说明硫脲壳聚糖-Ag配合物对葡萄白腐菌的抑制效果最好. 相比而言，对番茄灰霉菌，低浓度硫脲壳聚糖-Ag配合物的抑菌率小于10%，抑制菌丝的生长效果比较差. 由此可以得出，同一样品相同浓度对不同病原菌菌丝的生长的抑制作用的关系为葡萄白腐菌>苹果腐烂菌>苹果轮纹菌>苹果斑点落叶菌>番茄灰霉菌.

3 结论

本研究合成的不同银含量的硫脲壳聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)对细菌的抑菌效果均很好，与日常生活中常用的防腐保鲜剂二乙酸钠和苯甲酸钠相比，抑菌浓度分别是硫脲壳聚糖-Ag配合物的100倍和200倍[11]. 对5种病原菌，除了番茄灰霉菌，4个样品硫脲壳聚糖-Ag配合物均有较强抑制作用. 不同浓度的不同样品对葡萄白腐菌的抑菌率均大于70%；同一样品相同浓度对不同病原菌菌丝的生长的抑制作用的关系为葡萄白腐菌>苹果腐烂菌>苹果轮纹菌>苹果斑点落叶菌>番茄灰霉菌. 另外，抑菌性能测试效果还与测试方法本身及系统中的指示菌浓度有关，合成的样品的抑菌效果在不同实验中显示出抑菌性能的差异，但同样显示出了硫脲壳聚糖-Ag配合物的抑菌性能较合成前的壳聚糖有显著的增强.

表2 不同样品对病原菌菌丝生长的抑菌率Table 2 The inhibitory rate of different samples on pathogenic fungi

表3 不同浓度对病菌菌丝生长的抑菌率Table 3 The inhibitory rate of different concentrations on pathogenic fungi

参考文献：

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