染料木素分子印迹聚合物的制备及其识别性能研究

郭秀春，李欢欢，周文辉*

(1.河南大学 药学院，河南 开封 475004； 2.河南大学 特种功能材料重点实验室，河南 开封 475004)

分子印迹技术(MIT)是从仿生角度，采用人工方法制备对特定分子(模板)具有专一性结合的高分子技术. 这种高分子材料被称为分子印迹聚合物(MIPs). 通过对模板分子的分子印迹之后，在高分子基质中就形成了在三维空间大小、形状以及功能配基都与模板分子互补的分子印迹微腔，从而实现对模板分子的特异性识别，这种特异性甚至可以和单克隆抗体相媲美. 自从1972 年德国的WULFF课题组首次提出了分子印迹聚合物的概念[1-2]，1993年MOSBACH等在Nature上发表分子印迹及其仿生免疫分析应用的文章后，这一技术更为迅猛地发展起来[3]. 由于MIPs具有很好的选择性，同时具有高度稳定性和使用寿命长等优点，分子印迹技术已在化学仿生传感器、抗体模拟酶、人工酶催化剂、色谱固定相、药物手性分离、药物控制释放等诸多领域，显示出诱人的应用前景，已成为目前国际研究热点课题[4-6]. BJARNASON等[7]首次报道了MIPs材料用于SPE，研究结果表明以MIPs作为固相萃取材料进行固相萃取，选择性较高且几乎不存在杂质干扰. 从此，分子印迹固相萃取成为固相萃取研究的热点之一，也成为分子印迹技术显示其优越性的重要应用领域之一[8].

染料木素，又名金雀异黄酮，属异黄酮类化合物. 染料木素主要存在于豆科植物中，例如大豆、槐角等. 染料木素具有明显的抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化、雌激素功效、防治骨质疏松等众多的药理作用[9-12]. 目前，染料木素应用的剂型包括有栓剂、洗剂、注射液、片剂、胶囊等. 作者以染料木素为目标产物和模板分子，采用本体聚合法制备了染料木素的分子印迹聚合物，该印迹聚合物对染料木素具有特异的吸附性能. 本文作者以该印迹聚合物为吸附剂自制分子印迹聚合物固相萃取小柱并将其用于豆奶粉中染料木素的高效提取，成功地从市售豆奶粉中检测到了染料木素的存在.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

染料木素购自Sigma-Aldrich公司，4-乙烯基吡啶(4-VP)、乙二醇二甲基双丙烯酸酯(EGDMA)购自Alfa公司，偶氮二异丁腈(AIBN)购自北京化学试剂公司. THF、甲醇、乙酸、乙腈、丙酮为分析纯，实验用水为超纯水. 豆奶粉购自当地超市. DZF-6020型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)、TH-300A梯度混合器(上海沪西分析仪器厂)、QL-861漩涡振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司).

1.2 分子印迹聚合物的制备

染料木素分子印迹聚合物(以下简称“印迹聚合物”)的制备采用传统的本体聚合法. 制备过程如下：染料木素1 mmol(约270 mg)、4-乙烯基吡啶4 mmol(约430 μL)、乙二醇二甲基双丙烯酸酯20 mmol(约3.760 mL)、偶氮二异丁腈0.25 mmol(约40 mg)分散于10 mL THF中. 超声分散10 min，氮吹除氧10 min之后密封反应器，在氮气保护下油浴60 ℃反应24 h. 得到的块状聚合物经研钵研磨，过200～400目筛，得到粒径35～75 μm的聚合物颗粒. 用含10% (体积分数)乙酸的甲醇溶液置索氏提取器中提取48 h，除去模板分子及未反应的单体化合物. 然后用乙腈洗涤除去残留的乙酸和甲醇，聚合物颗粒经丙酮反复沉降，除去细颗粒后，60 ℃真空干燥至恒重，即为染料木素的印迹聚合物.

空白聚合物制备方法除不加染料木素之外，其他制备和洗涤步骤与染料木素的印迹聚合物制备方法完全相同.

1.3 分子印迹聚合物的识别性能

取20 mg上述分子印迹聚合物(或空白聚合物)加入5 mL浓度在0.5～50 μmol/L范围内的染料木素甲醇溶液中. 室温振荡反应5 h后高速离心，取上清液，并用紫外可见分光光度计在260 nm波长下检测上清液中染料木素的含量(标准曲线法)，最后根据溶液的浓度变化计算印迹聚合物(或空白聚合物)对染料木素的吸附量.

1.4 豆奶粉中染料木素的固相萃取

1.4.1 分子印迹固相萃取柱的灌装与活化

取彻底清洗干净的1 mL玻璃注射器为分子印迹固相萃取柱的柱体. 固相萃取柱灌装前，玻璃注射器底端用脱脂棉作为筛板，防止印迹聚合物颗粒的流失. 取100 mg印迹聚合物，以乙腈为匀浆液，进行湿法装柱. 待印迹聚合物稳定之后，氮气吹干固相萃取柱制得染料木素分子印迹聚合物固相萃取小柱(以下简称“固相萃取小柱”). 固相萃取小柱使用前依次用2 mL水、2 mL甲醇活化，氮气吹干备用.

1.4.2 豆奶粉提取液的制备

准确称取1 g豆奶粉，加入甲醇5 mL，漩涡振荡1 min之后超声提取30 min. 提取之后，样品在10 000 r/min转速条件下离心5 min，过滤所得上清液即为豆奶粉提取液.

1.4.3 豆奶粉提取液中染料木素的固相萃取

将豆奶粉提取液加至固相萃取小柱，以0.25 mL/min的速度过固相萃取小柱，并用氮气吹干固相萃取小柱. 之后依次用2 mL水和2 mL甲醇淋洗固相萃取小柱，流速为0.25 mL/min，并用氮气吹干固相萃取小柱. 最后用3 mL含5 %浓醋酸的甲醇洗脱，流速为0.25 mL/min，收集洗脱液. 洗脱液氮吹浓缩至干，用甲醇定容至1 mL进行HPLC检测.

图1 染料木素的分子结构Fig.1 Molecular structure of genistein

2 结果与讨论

2.1 印迹聚合物的制备

染料木素属于黄酮类物质，学名为 5,7,4′-三羟基异黄酮. 染料木素分子结构中具有三个酚羟基(分子结构如图 1)，整个分子成弱酸性并且极性较大，不溶于甲苯、氯仿、乙腈等分子印迹聚合物制备常用的溶剂中，在THF中的溶解度能够满足分子印迹聚合物制备的要求，因此实验中采用THF为溶剂和致孔剂. 由于染料木素分子结构中的酚羟基能够较好地与功能单体4-乙烯基吡啶分子结构中的吡啶基形成分子间氢键，因此实验中选择4-乙烯基吡啶为功能单体. 交联剂为乙二醇二甲基双丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈，采用最为常用热引发本体聚合技术制备染料木素的分子印迹聚合物.

2.2 印迹聚合物的识别性能

采用静态平衡法，测定了印迹聚合物对不同浓度染料木素的等温吸附曲线. 印迹聚合物对染料木素的吸附量采用公式Qn= (C0-Cn) ×V/m计算, 其中C0表示染料木素的初始浓度,Cn表示吸附平衡时染料木素的浓度，V为染料木素溶液的体积，m为印迹聚合物的质量，Qn表示单位质量印迹聚合物对不同浓度样品的吸附量. 其结果如图2所示, 可以看出印迹聚合物对染料木素的吸附容量随体系中染料木素的初始浓度的增加而增加. 在相同初始染料木素浓度条件下，印迹聚合物对染料木素分子的吸附容量明显高于非印迹聚合物的吸附容量，这表明印迹聚合物具有对染料木素分子的特异性分子识别能力.

2.3 印迹聚合物的选择性识别

为了研究印迹聚合物的选择吸附性, 实验中选择了和染料木素具有相似结构两种异黄酮类化合物：黄豆苷元和槲皮素进行比较. 通过静态平衡法测定印迹聚合物对不同异黄酮的吸附性能, 实验结果如图3所示. 可以看出以染料木素为模板分子制备的印迹聚合物对染料木素的吸附量要大于对其结构类似物的吸附量，而非分子印迹聚合物对染料木素和结构类似物的吸附大致相同，该结果表明所合成的分子印迹聚合物对染料木素具有一定的选择性吸附能力. 而非印迹聚合物对染料木素和结构类似物的吸附主要是非特异性的物理吸附，因此其吸附能力较弱.

图2 印迹(非印迹)聚合物对染料木素的吸附研究Fig.2 Amount of bound genistein by MIP (■) and NIP (●)

图3 印迹(非印迹)聚合物对染料木素及其结构类似物的选择性吸附Fig.3 Binding behavior of genistein and analogue on the MIP (or NIP)

2.4 利用固相萃取小柱结合HPLC测定豆奶粉中染料木素的含量

利用自制固相萃取小柱，按照1.4 所述豆奶粉中染料木素固相萃取方法，利用外标法测定了从当地超市购得的四种不同品牌豆奶粉中染料木素的含量，测定结果见表1.

表1 不同品种豆奶粉中染料木素的含量Table 1 Contents of genistein in different soybean milk powder

3 结论

本文以4-乙烯基吡啶为功能单体, 乙二醇二甲基双丙烯酸酯为交联剂, 偶氮二异丁腈为引发剂, 在THF中采用本体聚合法制备了对染料木素有特异识别性能的分子印迹聚合物. 以该印迹聚合物为吸附剂制备了对染料木素具有特异吸附能力的分子印迹固相萃取小柱，结合HPLC对豆奶粉中的染料木素进行了测定，豆奶粉中染料木素含量3.93～7.08 μg/g. 该印迹聚合物和固相萃取小柱有望在染料木素的高效提取和豆制品中染料木素的分析检测中得到应用.

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