葛根素、甲钴胺联合用药对糖尿病大鼠周围神经病变的作用机制

胡明财 章 卓 刘 剑 李晓冰 罗健华 李万平

(泸州医学院附属医院药剂科，四川 泸州 646000)

糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，据报道在糖尿病患者中伴有DPN和自主神经病变约占60%〔1〕。目前国内有关葛根素合用甲钴胺治疗DPN的疗效观察报道较多，疗效也较肯定，但两药联用的相关基础实验研究还未见报道。本实验着重观察葛根素和甲钴胺及两药合用对大鼠DPN的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性SD大鼠80只，重量在200～230 g左右，动物生产许可证号:SCXK(渝)20070006由重庆滕鑫动物公司提供。注射用葛根素由华北制药集团制剂有限公司生产，每支0.2 g产品批号:09090704;甲钴胺注射液由重庆药友制药有限责任公司生产，1 ml;0.5 mg产品批号0910010;链脲佐菌素(STZ)美国Sigma公司产品批号HO250;95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为国内试剂公司生产，分析纯。超氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)试剂盒及钠钾(Na+-K+)ATP酶试剂盒，均购自南京建成生物技术有限责任公司。

1.2 实验仪器及设备 罗氏活力型血糖仪(ACCU-CHEK?Active)Ⅰ型，美国罗氏ACCU-CHEK公司血糖测试条;紫外分光光度计(DMS200，UVVISIBLE Spectrophotometer，Varian，美国);RM6240生理机能实验系统，成都仪器厂;磁力搅拌器791型，南汇电讯器材厂。

1.3 造模及给药 大鼠后适应性喂养1 w，随机分为正常对照组(10只)和糖尿病模型组(70只)，造模前禁食12 h，(STZ以pH4.2，0.1%枸橼酸新鲜配制配制)，腹腔注射(55 mg/kg);正常对照组仅注射同等量的枸橼酸缓冲液。72 h后将大鼠断尾测血糖值，筛选血糖＞16.7 mmol/L大鼠为成模。取成功制得模型的62只大鼠，随机分组为4组，单用甲钴胺组、单用葛根素组、甲钴胺和葛根素合用组和不给药的模型组。每组10只。剂量计算参考药理实验剂量体表面积比值法〔2〕，均为早上定时注射给药，左右下腹注射交替进行，正常组每天同时注射等体积生理盐水，连续给药8 w。

1.4 血糖测定 造模后72 h以及给药后2、4、8 w后，取尾部末梢空腹血1滴用罗氏试纸配合血糖仪检测血糖。

1.5 坐骨神经传导速度(SNVC)的测定 连续给药8 w后，于禁食后12 h处理动物。首先给予大鼠1%戊巴比妥钠(25 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定。切开皮肤，分离股四头肌肉组织至坐骨切迹，分离坐骨神经，过程中注意用甘油保护坐骨神经，用玻璃分针将坐骨神经轻轻拉起，以钩状电极作为刺激电极置于坐骨切迹处，踝部和足底第二趾间分别插入白色记录针电极，一对红色参考电极置于记录电极和刺激电极之间，大约位于腓肠肌处。测试时保持肌体温度在37℃左右。并连接RM6240生物机能实验系统，选择肌肉神经实验-神经干兴奋传导速度测定。实验参数设定:模式细电压;方式单刺激;延时5.0;波宽0.05 ms;强度1.0 V;波间隔99。记录近、远端坐骨神经产生动作电位的潜伏期，测定两记录电极间的距离。神经传导速度=记录电极之间的距离/动作电位潜伏期之差，重复电刺激三次取平均值。

1.6 坐骨神经组织SOD、MDA及Na+-K+-ATP酶活性测定SNVC测定后，取大鼠坐骨神经组织，并准确称取坐骨神经的重量，按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性、硫代巴比妥酸法测定MDA含量;钠钾ATP酶的测定，具体操作方法按试剂盒说明进行。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 血糖浓度测定结果 注射STZ前大鼠空腹血糖水平均在(4.8±0.21)mmol/L。注射 STZ后 72 h，以空腹血糖 ＞16.7 mmol/L为造模成功的标准。并于造模后2、4、8 w末分别检测血糖水平。甲钴胺组和模型组血糖水平无统计差异(P＞0.05)，葛根素组、合用组与模型组之间的血糖水平有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

表1 大鼠造模后不同时间空腹血糖浓度(mmol/L， s，n=10)

表1 大鼠造模后不同时间空腹血糖浓度(mmol/L， s，n=10)

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

4.86±0.18 4.93±0.16 5.03±0.15 4.87±0.19模型组 20.78±1.931) 21.26±1.711) 23.64±1.881) 24.5±1.741)甲钴胺组 21.31±1.81) 22.78±1.971) 23.17±1.891) 21.21±1.141)葛根素组 20.45±1.121) 19.51±1.641)18.90±1.311)2)18.44±0.881)2)甲+葛组 21.63±0.721) 20.47±0.851)19.43±0.911)2)18.50±0.921)2)72 h 2 w 4 w 8 w对照组组别

2.2 各组SNVC比较 与对照组〔(49.36±5.62)m/s〕相比，各用药组大鼠SNVC均减慢(P＜0.05);与模型组〔(20.97±3.57)m/s〕相比各组大鼠SNVC均有提高(P＜0.05)，以合用组〔(39.17±3.36)m/s〕效果为最好;甲钴胺组〔(37.58±4.81)m/s〕与合用组相比无统计学差异(P＞0.05)，甲钴胺和葛根素组〔(25.20±2.94)m/s〕相比有显著性差异(P＜0.05)。

2.3 坐骨神经组织SOD/MDA/Na+-K+-ATP酶的测定 模型组坐骨神经组织 SOD含量与对照组比较明显降低(P＜0.01)。甲钴胺组SOD升高最明显，合用组与甲钴胺组作用接近，与模型组比较有统计学意义(P＜0.01)。与对照组比较，各组MDA均显著升高(P＜0.01);与模型组相比，各用药组大鼠MDA均显著降低，以合用组降低较明显(P＜0.01)。模型组大鼠Na+-K+-ATP酶活性比对照组明显降低(P＜0.05);各治疗组均可升高Na+-K+-ATP酶活性，联合用药组作用最明显。见表2。

表2 大鼠坐骨神经组织SOD、MDA、Na+-K+-ATP酶的含量(n=10，s)

表2 大鼠坐骨神经组织SOD、MDA、Na+-K+-ATP酶的含量(n=10，s)

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01

组别 Na+-K+-ATP酶(μmolPi/mg·h)MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)0.86±0.14 1.69±0.72 408.53±73.4模型组 0.37±0.081) 2.95±0.481) 204.47±31.451)甲钴胺组 0.75±0.152) 2.05±0.841) 319.36±45.42)葛根素组 0.43±0.12 1.93±0.672) 288.53±87.42)甲+葛组 0.78±0.212) 1.84±0.842) 304.25±64.62)对照组

3 讨论

多元醇通路代谢增强是引起DPN发生的重要机制〔3〕。醛糖还原酶是多元醇代谢异常所涉及的关键酶，其活性增高可使多元醇通路激活，使神经细胞内山梨醇等渗透压物质增多，导致细胞肿胀，引起周围神经组织结构的损伤改变;通过继发机制还可增加氧自由基的生成、干扰一氧化氮的合成、提高非酶糖基化反应水平、引起神经组织“伪缺氧”、降低Na+-K+-ATP酶活性以及减慢神经传导速度等，导致血管和神经细胞功能障碍及神经组织结构的改变〔4，5〕。

甲钴胺〔6〕是维生素B12的衍生物，可顺利地渗入神经细胞内，促进核酸、蛋白质、磷脂的生物合成，使髓鞘形成和突触再生，修复受损的神经纤维，提高传导速度。葛根素注射液是豆科植物葛根中提取的单体一异黄酮化合物，研究发现〔7～10〕葛根素可改变血流动力，降低血液黏度，抑制血小板聚集，减少血浆纤维蛋白原含量;改善微循环，增加神经的血氧供应;改善代谢，抑制醛糖还原酶活性，减少三梨醇、果糖生成，抑制蛋白质非酶糖基化水平等。

本研究结果表明葛根素和甲钴胺合用不仅可明显提高糖尿病大鼠SNVC，同时也可降低大鼠血糖水平，减少神经组织自由基生成，改善多元醇代谢，减轻坐骨神经组织病理损害，从而产生良好的协同作用。其可能的机制与抑制体内自由基生成，减轻氧化应激损伤、改善多元醇代谢从而减轻神经组织病理损伤有关。

1 宁 光.糖尿病周围神经病变诊断研究进展〔J〕.中国实用内科学杂志，2007;27(7):487-9.

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3 张晓晨，金锦娣，顾受良，等.蛭萸方对糖尿病性周围神经炎的药效学研究〔J〕.中成药，2002;24(7):522-5.

4 封卫毅，侯家玉，陈 伟，等.周络通对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经功能影响〔J〕.中成药，2004;26(4):318-21.

5 Sima AAF，Sugimoto K.Experimental diabetic neuropathy:an update〔J〕.Diabetologia，1999;42:773-88.

6 刘 莉，王修乾.甲钴胺治疗糖尿病神经病变临床观察〔J〕.中国慢性病预防与控制，2000;8(6):249.

7 林甲宜，戴 伦，徐结桂，等.葛根索注射液治疗糖尿病周围神经病变的疗效观察〔J〕.中国糖尿病杂志，2000;8(5):269.

8 钟星明，江丽霞，刘春棋，等.葛根素对大鼠抗氧化酶活性作用的研究〔J〕.赣南医学院学报，2006;(4):485-6.

9 郝丽娜，凌毅群，罗秀梅，等.葛根素减轻部分由过氧亚硝基阴离子导致的糖尿病大鼠晶状体上皮细胞凋亡〔J〕.生理学报，2006;58(6):584-92.

10 宋淑珍，房征宇，田亚平.葛根总黄酮对过氧化氢所致PC12细胞氧化损伤的防护〔J〕.中国临床康复，2006;10(31):171-3.