雷帕霉素联合热疗对T24细胞体外生物学行为的影响及相关机制

孟 勇 回学军(白山市中心医院，吉林 白山 34300)

膀胱肿瘤的生物学行为之一是肿瘤多中心性、呈多点灶状分布，造成肿瘤易复发、转移〔1〕。热灌注化疗可充分发挥热疗和化疗的协同作用，提高膀胱肿瘤的治疗效果。本研究应用T24细胞为靶点，观察雷帕霉素联合热疗对T24细胞的生物学行为，为人膀胱癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人膀胱癌T24细胞株，吉林省肿瘤研究所惠赠，雷帕霉素为美国Wyeth公司产品，MTT试剂，RPMI1640培养基购于Sigma公司，胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1.2 MTT比色法 取对数生长期的人膀胱癌T24细胞，调细胞数为2×105/ml，接种于96孔塑料培养板内100 μl/孔，当细胞生长达到80%汇合时分组，热疗组43℃ ±0.2℃持续加热40 min，然后移入37℃、5%二氧化碳培养箱内静止培养。根据预实验结果，雷帕霉素最佳剂量为10 μg/ml，联合组在单纯热疗条件下再加雷帕霉素10 μg/ml，然后移入37℃、5%二氧化碳培养箱内静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h后，吸弃上清加入二甲基亚砜150 μl/孔，震荡10 min，使MTT还原产物完全溶解，于酶标仪570 nm处测量各孔吸光度A值，按下列公式计算T24细胞增殖抑制率〔(1－加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100%〕。

1.3 流式细胞术 细胞培养及分组同1.2，不同之处是将96孔培养板改为25 ml培养瓶，培养结束后细胞经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定。上机前过40目网，调细胞数为1×106/ml，PI染色，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 MTT结果 不同条件对T24细胞的增殖抑制率均有影响，与对照组相比差异显著，且联合组效果最明显。见表1。

2.2 流式细胞术结果 不同条件对T24细胞周期各时相均有影响，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，细胞凋亡率升高，尤其是联合组改变明显。见表2。

表1 不同条件对T24细胞的增殖抑制率(s)

表1 不同条件对T24细胞的增殖抑制率(s)

组别 A值 抑制率(%)P值1.53±0.13 － －热疗组 1.24±0.16 19.1 ＜0.01雷帕霉素组 1.12±0.18 26.8 ＜0.01联合组对照组0.78±0.11 49.1 ＜ 0.01

表2 不同条件T24细胞周期各时相及凋亡率( s，%)

表2 不同条件T24细胞周期各时相及凋亡率( s，%)

与对照组比较:1)P＜0.05;2)P＜0.01

33.5±2.3 63.4±3.1 3.1±1.6 1.5热疗组 46.2±4.11)39.4±4.42)14.4±1.92) 10.92)雷帕霉素组 50.6±4.42)29.7±3.72)19.6±3.22) 13.62)联合组 63.7±3.52)13.1±2.32)23.2±3.52) 17.32)凋亡率对照组组别 G0/G1 S G2/M

3 讨论

近年来，热疗因其安全有效而逐渐成为继手术、放疗、化疗及生物治疗后又一肿瘤治疗手段。新近研究表明，热疗配合放疗或化疗可显著提高肿瘤的局部控制率及患者的生存率〔2〕。文献报道〔3〕，S期细胞对热敏感，受热后损伤严重，可形成多核细胞，分裂后死亡。RPM是从吸水性链霉菌发酵液中提取出来的大环内酯类抗生素，具有良好的抗肿瘤作用。研究证明RPM主要阻断肿瘤细胞周期G1期，且具有良好的抑制肿瘤细胞生长的作用〔4〕，影响细胞的DNA合成，阻止G1期向S期转化进程，造成G1期细胞增多，不能进入S期。根据流式细胞仪结果可以初步认为热疗与RPM联合应用既能抑制细胞周期G1期的进程，又能抑制S期细胞，从而使G2/M期细胞增多，而G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应〔5〕。

综上，热疗与化疗具有协同作用，热疗可使细胞膜的通透性和流动性改变，从而导致细胞内环境发生变化〔6〕，有利于抗肿瘤药物吸收，促进药物进入肿瘤细胞，充分发挥其抗癌作用。

1 雷 鸣，崔书中，巴明臣.热灌注化疗治疗膀胱癌的研究进展〔J〕.实用医学杂志，2012;28(2):169-71.

2 韩成敏，李青山，孙 冬，等.士贝母制剂联合热疗诱导Tca8113细胞凋亡及其对细胞周期进程影响〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(3):299-301.

3 Brtek J，Lukas J.Mammalian G1 and S-phase checkpoints in response to DNA damage〔J〕.J Curr Opin Cell Biol，2001;13(6):738-47.

4 Hansel DE，Platte A，Orloff M，et al.Mammalian target of rapamycin(m TOR)regulates cellular proliferation and tumor growth in urothelial carcinoma〔J〕.Am J Pathol，2010;176(6):3062-72.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔M〕.Genes Celss，2000;5(6):491-8.

6 Lim CU，Zhang Y，Fox MH，et al.Cell cycle dependent apoptosis and cell cycle blocks include by hyperthermia in HL-60 cells〔J〕.Int J Hyperthermia，2006;22(1):77-91.