缬沙坦对大鼠急性心肌梗死后F-肌动蛋白与热休克蛋白27表达的影响

陈 杰，张丽华，牛少辉

郑州大学第二附属医院心血管内科 郑州 450014

心肌梗死(myocardial infarction，MI)后心室重构(ventricular remodeling，VRM)涉及多因素的复杂调控，细胞骨架蛋白包括其蛋白纤维网络结构的各个成分，起着维系心肌形态的关键作用，骨架的变化必然引起心肌结构和功能的改变，导致VRM的发生发展。血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blockades，ARBs)通过全面阻断肥厚刺激性因素血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的作用而改善VRM，降低MI的发病率及病死率[1]，但对MI后心肌纤维化和细胞骨架蛋白的作用仍处于探索阶段。该研究以MI大鼠为模型，通过测定梗死后心肌组织中热休克蛋白27(HSP27)、F-肌动蛋白(F-actin)蛋白和mRNA的表达和变化，探讨缬沙坦对大鼠MI后细胞骨架蛋白的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1主要材料健康成年雄性Wistar大鼠60只，体质量220～250 g，由河南省实验动物中心提供。兔抗HSP27、F-actin多克隆抗体购自郑州博瑞生物科技有限公司；HSP27、F-actin和β-actin(内参)引物购自北京博大泰克公司。缬沙坦片，80 mg/片(国药准字J20070026，进口药品注册证号BH20060395)。Hx-100E小动物呼吸机购自成都豢肇科技公司；基因扩增仪购自Eppendorf公司；nYY-6c型电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.2大鼠MI模型制作及分组Wistar大鼠采用随机数字表法分为MI组、缬沙坦组(X组)、正常对照组(N组)、假手术组(SH组)，每组15只。大鼠经体积分数10%水合氯醛溶液300 mg/kg麻醉满意后，固定于手术台上，并连接心电图肢体导联。备皮、消毒，在第4肋间处做一横行切口，逐层分离皮下组织及胸大肌，至暴露出肋骨及肋间肌，此时接呼吸机，打开胸腔、暴露心脏、剪开心包、挤出心脏，以无损伤缝合针在左心耳与肺动脉圆锥之间穿过冠状动脉前降支，并将缝线扎紧。心电图显示Ⅰ和avL导联ST段呈弓背向上抬高提示手术成功。SH组只在相同部位穿线，不结扎，其余步骤同手术组[2]。术后X组每天给予缬沙坦15 mg/kg(溶于1 mL生理盐水)灌胃，另3组给予等体积生理盐水灌胃，灌胃4周。

1.3心脏标本提取和处理经4周喂养后，MI组存活大鼠11只，X组存活13只，SH组和N组存活15只。将存活大鼠颈椎脱臼处死，取左心室前壁MI区为标本。

1.4心肌组织形态学分析在体积分数10%甲醛溶液中固定心肌组织，常规脱水，石蜡包埋，6 μm厚连续切片，分别进行HE染色、镜检。

1.5心肌组织HSP27、F-actin蛋白表达的免疫组化检测采用免疫组化SP方法，具体步骤按照试剂盒说明操作，DAB显色。用已知阳性切片作为阳性对照，0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察，棕黄色颗粒为HSP27、F-actin阳性表达。每张切片取5个400倍视野进行图像采集，应用Biosens Digital Imaging System v1.6对所采集照片的相关免疫组化染色的光密度值进行测量，重复3次，取平均值。

1.6心肌组织HSP27和F-actinmRNA表达的检测每只大鼠分别取100 mg心脏组织，加入Trizol液 1 mL中研磨吹打成匀浆后抽提RNA，逆转录为cDNA(逆转录试剂盒为Transgene公司产品)。引物序列为：HSP27(262 bp)，上游5’-TGGACAATGG CAAGGTAGCG-3 ’，下游5’-TGGGCAATGGGTTGGT AATC-3’；F-actin(700 bp)，上游5’-GCTAAGAAGG CGATACAA-3’，下游5’-AGAATGAGGACTGGGTG A-3 ’。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μL扩增产物与缓冲液混合后经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析，目的基因mRNA的表达量以目的基因条带和β-actin条带灰度值比值计算。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行统计学分析。4组间F-actin、HSP27蛋白和mRNA表达的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；各组F-actin、HSP27蛋白和mRNA相对表达量间采用Pearson积差相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1心肌组织形态学观察4周后组织切片HE染色显示：N组和SH组心肌细胞排列整齐，无肌纤维破坏，细胞质丰富均匀，心肌细胞间隙正常；MI组心肌细胞排列紊乱，心肌组织受损，可见心肌细胞广泛水肿，心肌细胞间隙明显增宽，胶原纤维增生显著，梗死区周边可见有新生血管形成；X组心肌细胞排列及胶原纤维增生程度介于N组与MI组(图1)。

2.2免疫组化结果免疫组化染色示，N组和SH组可见微量的棕黄色颗粒沉着，主要分布于细胞周边；MI组可见大量的棕黄色颗粒，主要分布于细胞中央；X组可见中等量棕黄色颗粒，周边和中央均有分布。结果见图2，表1。

图1 各组大鼠心肌组织结构变化(HE，×400)

图2 F-actin和HSP27蛋白的免疫组化染色结果(SP，×400)

2.3RT-PCR结果见图3，表2。

2.4相关性分析结果MI组中F-actin和HSP27蛋白表达量呈正相关(r=0.807，P=0.003)，F-actin和HSP27 mRNA表达量呈正相关(r=0.615，P=0.044)；X组中F-actin和HSP27蛋白表达量呈正相关(r=0.805，P=0.001)，F-actin和HSP27 mRNA表达量呈正相关(r=0.762，P=0.002)。N组和SH组F-actin和HSP27 mRNA表达量无关(r=-0.035，P=0.902；r=-0.455，P=0.088)；F-actin和HSP27蛋白表达量无关(r=0.218,P=0.436;r=-0.170,P=0.564)。

图3 F-actin与HSP27 mRNA电泳结果

组别nF-actin蛋白HSP27蛋白MI组112.216±0.022∗2.230±0.026∗X组132.132±0.014∗#2.140±0.014∗#SH 组151.972±0.029#2.036±0.017#N组151.988±0.026#2.023±0.020#F310.587312.760P<0.001<0.001

*与SH组比较，P<0.05；#与MI组比较，P<0.05。

表2 各组大鼠心肌组织F-actin和HSP27 mRNA相对表达量比较

*与SH组比较，P<0.05；#与MI组比较，P<0.05。

3 讨论

细胞骨架由微丝、中间丝和微管及相关的骨架蛋白组成[3]，其中微丝主要由3类蛋白质组成：actin、肌球蛋白和actin结合蛋白。actin有球状单体(G-actin)和丝状聚合体(F-actin)2种形式，F-actin为双螺旋状的微丝，是由多个相对分子质量为 42 000 的球状单体以非共价键结合形成的2条多聚体单链，G-actin不断地加入或脱落，使F-actin保持着聚合和解聚的动态平衡，维持细胞骨架的形态和功能[4]。单体和聚合体之间的平衡转换与其对细胞功能的调节密切相关，当各种致病因素打破这种平衡后，F-actin发生聚合和重排，细胞周边的actin环断裂，细胞中央出现大量呈束状密集排列的应力纤维，这时细胞中心张力增加使细胞逐渐收缩，细胞间隙增大、增多，最终导致通透性升高[5]，致使细胞骨架重构，功能受损。HSP27是HSP家族的成员之一，除具有分子伴侣活性，还是一种重要的actin结合蛋白，有调控actin细胞骨架方面的作用[6]。现已发现以单聚体、非磷酸化状态存在的HSP27作为帽状蛋白结合在F-actin的5’端，它通过抑制actin的聚合，进而达到稳定和保护actin细胞骨架的作用[7]。AngⅡ和热刺激可以诱导高水平的HSP27的表达[8-9]。缬沙坦是ARBs，在调节全身血压、改善VRM方面起关键作用。近年来AngⅡ成为细胞骨架与重构方面的研究热点。张进[1]研究表明MI 4周后AngⅡ明显增高，可能是心肌病理性肥大和VRM始动的分子机制之一。刘敬[10]研究表明AngⅡ通过p38MAPK/HSP27信号通路的激活，诱导细胞骨架F-actin重排，导致应力纤维形成。

该实验结果显示，光镜下HE染色示N组和SH组心肌细胞排列整齐，无肌纤维破坏；MI组心肌细胞排列紊乱，胶原纤维增生显著；X组可见心肌细胞排列及胶原纤维增生程度介于N组与MI组。提示心肌组织重构是梗死后重要病理变化。免疫组化与RT-PCR结果显示，与SH组比较，HSP27、F-actin蛋白和mRNA表达量在MI组和X组均升高；且MI组和X组HSP27和F-actin蛋白、mRNA的表达呈正相关。从转录和翻译水平提示，MI后F-actin蛋白含量增加，即聚合的actin增多导致细胞骨架出现重构，可能是致使心肌重构功能受损的重要的病理生理机制。而X组细胞骨架蛋白受损程度较轻，F-actin蛋白和mRNA表达量较MI组低，提示缬沙坦通过拮抗F-actin蛋白的表达保护骨架正常功能，可能是缬沙坦保护梗死后心肌功能的一个重要机制。HSP27和F-actin蛋白、mRNA的表达呈正相关，提示HSP27和F-actin蛋白在MI后细胞骨架的重构、损伤的发生中可能起协同作用。

总之，该实验初步表明，大鼠MI后心肌组织中F-actin、 HSP27表达增加，可能是导致细胞骨架受损、VRM的重要因素；缬沙坦干预后F-actin、 HSP27表达减少，VRM减轻。作者推测，MI后可能AngⅡ升高，通过激活p38MAPK/HSP27信号通路，使磷酸化的HSP27增多，磷酸化HSP27脱落进入胞质，使HSP27在F-actin的5’端帽状蛋白功能丧失，F-actin发生聚合和重排，从而造成应力纤维和细胞间隙增加，导致细胞骨架重构，功能受损。缬沙坦作为ARBs可以拮抗这一过程，从而保护细胞骨架，减少心肌细胞坏死，具体机制尚需要进一步探究。降低AngⅡ水平，抑制HSP27磷酸化，避免F-actin聚合重排，可能为MI的治疗开辟新的领域，值得进一步研究。

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