有氧运动和白藜芦醇对II型糖尿病大鼠肝脏氧化应激及NF-κBp65的影响

曹姣，肖国强

（华南师范大学 体育科学学院，广东 广州 510006）

当前，糖尿病已成为全世界危害人类健康的严重性疾病之一，其中 II型糖尿病(T2DM)占到该人群的90%[1]。T2DM是以高血糖和胰岛素抵抗(IR)为主要特征的一种代谢综合症，常伴随有脂代谢异常如脂质异位沉积[2]，特别是沉积在肝脏、骨骼肌引起氧化应激和IR等，氧化应激和炎症参与 IR和肥胖相关的代谢紊乱，可通过引起一系列变化导致糖尿病并发症的发生发展[3]。SREBPs(包括SREBP1和SREBP2)是一组螺旋-环螺旋亮氨酸拉链转录因子家族，在代谢率较强器官中高表达，调控胆固醇和脂肪酸代谢的相关酶基因，在脂肪生成、胰岛素敏感性和脂肪酸稳态中扮演非常重要作用的角色[4]。NF-κB为启动炎症反应的重要转录因子，研究发现，选择性敲除高脂饮食大鼠肝脏NF-κB能抑制脂质介导的IR，提示NF-κB在其中起重要作用，可能作为防治IR相关疾病的靶标[5]。

规律运动作为一种非药理学治疗手段[6]，具有的多效功能能显著改善 T2DM大鼠高血糖、氧化应激、IR和代谢综合征等[1]，但能否通过 SREBPs、NF-κBp65改善肝脏氧化应激和炎症尚不清楚。白藜芦醇(Res)属于芳香植物营养素中的一种多酚类化合物，具有抗氧化[7]、抗炎症[8]和抗细胞凋亡等，能较好改善IR[9]和T2DM的氧化应激状态[7]，然而对T2DM肝脏的具体作用机制尚不明确。并且将有氧运动和白藜芦醇联合作为一种新型的干预手段，是否对T2DM有更好的作用？尚未被研究。因此，本研究通过开展7周游泳训练及Res干预，探讨有氧运动和Res对T2DM肝脏的作用机制及联合作用效应，旨在为防治T2DM及其并发症提供一定的实验依据和理论基础，为临床治疗提供新的研究思路和方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠(购自广州中医药大学实验动物中心)，体重(180±20) g。正常大鼠以普通饲料(购自广州中医药大学实验动物中心)喂养，T2DM 造模组大鼠以高糖高脂饲料喂养。高糖高脂饲料配方：20%蔗糖，10%猪油，5%蛋黄粉，0.2%胆酸钠，64.8%(均为质量比)。基础饲料由广州花都东信华实验动物养殖场配制。

1.2 T2DM模型大鼠造模

大鼠经高糖高脂饲料喂养5周后按35 mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，STZ现配现用，配好的STZ在避光条件下30 min内完成注射。注射3 d和7 d后，尾静脉取血测试随机血糖浓度，血糖浓度均≥16.7 mmol/L为成模大鼠。

1.3 实验分组

将40只健康SPF级雄性SD大鼠分为正常对照组(C组，8只)、II型糖尿病组(D组，8只)、“II型糖尿病＋运动”组(DE组，8只)，“II型糖尿病＋Res”组(DR组，8只)、“II型糖尿病＋运动＋Res”组(DER组，8只)。

1.4 运动训练方案

运动组大鼠进行为期7周不负重游泳训练，1周的适应性训练后(10 min/d)进行正式训练，训练时间为第 1周30 min/d，第 2周45 min/d，第3~7周 60 min/d，每周训练6 d。游泳在白色大水桶中进行，每桶4只动物，水深60 cm。

1.5 Res灌胃处理

Res溶于双蒸水中制成(6 mg/mL)悬浊液。采用灌胃的方法按照45 mg/(kg·d)对大鼠进行干预，灌胃组大鼠灌胃每周7 d。对照组大鼠灌以双蒸水。

1.6 标本采集与处理

7周游泳训练和Res给药干预，停止干预36 h后(避免急性运动效应)禁食 12 h，尾静脉取血检测空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素(FINS)。之后宰杀大鼠，利用质量分数为10%水合氯醛(3.5~4.0 mL/kg)进行麻醉后，5 min后宰杀大鼠，取肝脏称重并测定肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)，另取少部分组织置于液氮罐中保存待测肝脏中的TNF-a蛋白及SREBP1、SREBP2、NF-κBp65核蛋白。

1.7 检测指标及方法

1)FBG采用 JPS-5怡成血糖仪测定；FINS采用ELISA法测定；肝重采用电子天平测定；SOD、MDA、TG、TC均采用南京建成生物有限公司提供试剂盒测定；TNF-a、nSREBP1、nSREBP2、NF-κBp65 核蛋白测定(北京博奥森生物技术有限公司提供 TNF-a、NF-κBp65、SREBP1、SREBP2多克隆抗体)均参照李树基的Western-blot测试方法[10]。

2)胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)计算方法：HOMA-IR =FBG×FINS/22.5。

1.8 统计学方法

各组数据通过Excel2003和SPSS16.0软件包进行统计学分析。实验数据均以平均数±标准差表示，各处理组间数据比较采用双因素方差分析和两样本T检验，显著性水平为P<0.05，非常显著性水平为P<0.01。

2 结果与分析

2.1 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的变化

如表1所示，D组(T2DM组)与C组(正常对照组)比较，FBG、HOMA-IR 非常显著升高(P<0.01，P<0.01)，FINS显著升高(P<0.05)。与D组比较，DE组、DR组FINS、HOMA-IR显著下降(P<0.05)，DER组与D组比较，FINS非常显著降低(P<0.01)，而 HOMA-IR显著降低(P<0.05)。

表1 各组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR的变化

表1 各组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR的变化

与C组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与D组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

组别 n/只 c(FBG)/(mmol·L-1) ρ(FINS)/(ng·mL-1) HOMA-IR C 8 5.83±0.46 1.20±0.17 0.357±0.052 D 8 7.25±0.882) 1.54±0.091) 0.517±0.0762)DE 8 6.24±0.62 1.29±0.203) 0.382±0.0563)DR 8 6.60±0.28 1.25±0.423) 0.398±0.0253)DER 8 6.40±0.30 1.13±0.074) 0.367±0.0393)

2.2 各组大鼠肝脏氧化应激水平的变化

如表2所示，与C组比较，D组大鼠肝脏MDA质量摩尔浓度显著升高(P<0.05)，而 SOD活性显著下降(P<0.05)；与D组比较，DE组、DR组和DER组大鼠肝脏MDA质量摩尔浓度显著下降(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)，与DER组比较，DE组MDA质量摩尔浓度非常显著升高(P<0.01)，而DR组显著升高(P<0.05)，DE组、DR组和DER组SOD活性3组之间无显著性差异(P>0.05)。

表2 各组大鼠肝脏MDA表达、SOD活性的变化

表2 各组大鼠肝脏MDA表达、SOD活性的变化

与C组比较，1)P<0.05；与D组比较，2)P<0.05；与DER组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

组别 n/只 b(MDA)/(nmol·mg-1) SOD活性/(U·mg-1)C 8 18.96±0.60 506.13±35.12 D 8 30.24±1.071) 438.95±32.261)DE 8 24.71±0.132)4) 477.62±30.562)DR 8 23.41±1.912)3) 439.39±26.642)DER 8 19.29±0.792) 501.01±29.612)

2.3 各组大鼠肝脏脂质各指标的变化

1)各组大鼠肝指数及TG、TC的变化。

如表3所示，与C组比较，D组肝指数、肝脏TG、TC均非常显著升高(P<0.01)，与 D组比较，DE组、DR组和 DER组肝指数、肝脏 TG、TC均显著下降(P<0.05)，而DE组和DR组较DER组表现为显著升高(P<0.05)。

表3 各组大鼠肝指数及TG、TC的变化

表3 各组大鼠肝指数及TG、TC的变化

与C组比较，1)P<0.01；与D组比较，2)P<0.05；与DER组比较，3)P<0.05

组别 n/只 肝脂数/% w(肝脏TG)/(mg·g-1)w(肝脏 TC)/(mg·g-1)C 8 2.26±0.00 13.32±0.32 3.21±0.14 D 8 5.07±0.011) 32.66±0.561) 7.58±2.101)DE 8 3.23±0.012)3) 25.76±0.552)3) 5.54±1.562)3)DR 8 3.32±0.012)3) 24.91±0.132)3) 5.12±2.642)3)DER 8 3.01±0.002) 18.56±0.412) 4.10±1.232)

2)各组大鼠肝脏SREBPs(SREBP1和SREBP2)核蛋白(nSREBPs)的表达。

由图1可知，与C组比较，D组肝脏中nSREBP1的表达显著升高(P<0.05)，与 D组比较，DE组、DR组、DER组肝脏nSREBP1的表达显著降低(P<0.05)，与DER组比较，DE组、DR组肝脏中nSREBP1表达显著升高(P<0.05)。由图2可知，与C组比较，D组肝脏nSREBP2表达升高，无显著性差异(P>0.05)；与D组比较，DE组、DR组、DER组肝脏中nSREBP2表达逐步呈降低趋势(P>0.05)。

图1 不同组别大鼠肝脏中nSREBP1的表达

图2 不同组别大鼠肝脏中nSREBP2的表达

2.4 各组大鼠肝脏炎症反应水平(TNF-a)、NF-κBp65核蛋白表达的变化

由图3、图4可知，与C组比较，D组肝脏中TNF-a、NF-κBp65核蛋白表达非常显著升高(P<0.01，P<0.01)，与D组比较，DE组、DR组、DER组肝脏中TNF-a、NF-κBp65核蛋白表达均显著降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，与DER组比较，DE组、DR组肝脏中TNF-a、NF-κBp65核蛋白表达均显著升高(P<0.05，P<0.05)。

图3 不同组别大鼠肝脏中TNF-α的表达

图4 不同组别大鼠肝脏中NF-κBp65核蛋白的表达

3 讨论

本实验结果显示，7周有氧运动或Res能显著降低T2DM大鼠血清FINS和HOMA-IR，与相关研究结果相一致[11]，而运动和 Res联合干预与单一干预比较能进一步降低T2DM血清FINS和HOMA-IR，尽管无显著性差异(P>0.05)。

氧化应激是糖尿病及其并发症共同的发病机制。然而在T2DM中，肝脏由于代谢紊乱和肝脏IR，成为遭受应激的最主要器官。氧化应激与IR之间存在紧密联系[12]。TNF-a也能直接或间接介导IR状态[13]。因此，本研究就 T2DM肝脏氧化应激和炎症之间的分子联系，探讨有氧运动和Res对T2DM大鼠肝脏氧化应激和炎症影响及可能的作用机制。

3.1 有氧运动和Res对T2DM大鼠肝脏氧化应激的影响

肝脏中脂质过氧化物反映脂质过氧化程度，可以MDA质量摩尔浓度变化来表示。研究表明，经高脂饮食后，大鼠肝脏氧化应激增加，所引起的氧化损伤是IR和代谢综合症的发病原因[14]。氧化应激过程中产生的活性氧(ROS)可通过激活各种应激敏感性细胞内信号通路，包括NF-κB、p38MAPK、JNK/SAPK、PKC和多元醇通路间接损伤细胞。文献表明，在实验性糖尿病大鼠肝脏中脂质过氧化产物水平升高[15]。我们的研究结果显示，T2DM大鼠肝脏中MDA质量摩尔浓度显著升高，而SOD活性显著下降，表明T2DM大鼠肝脏氧化应激加强。经过 7周有氧运动后，T2DM大鼠MDA质量摩尔浓度显著下降，而SOD活性显著升高，与相关研究结果相一致[16]。Res能改善T2DM大鼠的氧化应激[7]，我们的研究结果进一步表明，7周Res干预能显著改善T2DM大鼠肝脏的氧化应激，此外，经7周有氧运动联合Res较单一干预，其肝脏中MDA水平进一步下降(P<0.01，P<0.05)，且 SOD活性呈升高趋势，表明肝脏氧化应激得到更好的改善。

脂质的过度堆积导致线粒体中脂肪酸β氧化不充分，ROS生成增多，脂质过氧化物产生增多，导致氧化应激。SREBPs是膜结合转录因子，控制胆固醇和脂肪酸代谢相关酶基因的表达，调节脂肪生成、胰岛素敏感性和脂肪酸稳态。SREBP家族包括SREBP1(SREBP1a、SERBP1c)和 SREBP2。前者在代谢活性较强器官中高表达，如肝脏、脂肪组织和骨骼肌，调节脂质代谢及胰岛素[4]，后者参与合成TC ，同时可调节血脂，影响动脉粥样硬化血管[17]。

目前关于运动对DM大鼠肝脏SERBP的影响仅徐国琴[18]有相关研究，该项研究表明，运动训练能降低DM大鼠肝脏中SREBP表达。至于SREBP哪一种亚型起作用或是否两者共同作用尚不清楚。本实验在此基础上进一步研究，结果显示，有氧运动干预后T2DM大鼠肝指数、肝脏TG、TC均显著下降(P<0.05)，控制脂质生成的转录因子 nSREBP1水平显著下降，而nSREBP2呈下降趋势，提示有氧运动能显著降低肝脏的脂质沉积，其机制可能通过作用于 nSREBP1。Res作为 SIRT1的一种强激活剂，可增加 SIRT1、AMPK的活性[19]，抑制SREBP1及PGC-1a活性，抑制慢性酒精性脂肪肝脂肪变性[20]。Res也能通过抑制脂肪变性细胞 SREBP1的表达及活性改善脂肪变性[21]。我们的研究结果显示，Res可通过抑制 T2DM大鼠肝脏中SREBP1激活减少肝脏的脂质沉积，而有氧运动和白藜芦醇联合干预较单一干预进一步降低肝脏中 TG、TC，可能部分通过降低T2DM大鼠肝脏SREBP1活性(减少nSREBP1)，改善肝脏脂质沉积引起的氧化应激。其原因可能与联合干预能更好改善肝脏的内质网应激有关。本实验中，经干预后，T2DM大鼠肝脏中作为调控TC的调节因子SREBP2活性未出现显著变化，而TC呈现显著降低，其具体原因有待进一步研究。

3.2 有氧运动和Res对肝脏炎症状态的影响

研究发现，有氧运动可降低高脂饮食介导的 IR大鼠、NAFLD大鼠、T2DM大鼠[22]肝脏中TNF-a的表达，改善肝脏炎症状态。我们的研究结果显示，7周游泳训练后，T2DM大鼠肝脏中TNF-a水平显著降低，与前人研究结果相一致。在炎性相关性疾病的机制研究中，研究学者目前已发现多条炎症信号转导通路，包括SIRT1/PGC-1a通路、NF-κB通路、AMPK通路、PI3K/PKB/eNOS通路等，其中NF-κB通路为细胞内极为重要的炎症信号转导通路。Arkan MC等[5]研究发现，大鼠选择性敲除肝脏NF-κB能抑制脂质介导的IR，提示NF-κB在其中起重要作用，可能作为防治IR相关疾病的靶标。NF-κB是由多肽链p50和p65 2亚基形成的二聚物。包括p50同源二聚物、p65同源二聚物、p50和p65异源二聚物，细胞内主要发挥作用的是其异源二聚体形式。未受应激情况下，NF-κB以无活性的化合物形式存在于胞浆中，一旦受到TNF-a、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子刺激，NF-κ B便被激活转位至细胞核内，促使机体分泌更多炎症因子，加剧炎症反应[23]。研究已发现DM肝脏中NF-κB被激活[24]。本实验中结果显示，T2DM 肝脏 NF-κBp65核蛋白显著增加，此外我们的实验还发现，经过7周运动后，不仅T2DM大鼠肝脏中TNF-a水平降低，而且NF-κBp65核蛋白减少，表明7周有氧运动可能通过抑制NF-κBp65活性，降低TNF-a改善肝脏炎症。

细胞水平研究表明，Res能抑制TNF-a介导的NF-κB激活[8]。动物实验研究表明，Res能显著降低高脂饮食肾脏[25]和T2DM大鼠胰腺[26]中NF-κBp65的表达及活性。然而对T2DM肝脏的研究尚未见到。我们的研究结果显示，Res能显著降低T2DM大鼠肝脏中的NF-κBp65的激活，同时下游TNF-a的水平也显著降低。表明，在体条件下，Res可通过抑制NF-κBp65的活性，降低TNF-a的水平，改善肝脏炎症反应。而7周有氧运动和Res联合干预后，T2DM大鼠肝脏中细胞核NF-κBp65水平较单一干预进一步降低，同时 TNF-a出现同样的变化趋势，表明联合干预较单一干预对T2DM大鼠肝脏炎症效果更为显著，其机制可能是通过抑制NF-κBp65，最终抑制TNF-a的表达而实现。

事实上，ROS介导的氧化应激是NF-κB的激活子，在经外源性 H2O2处理的细胞研究、促使内源性H2O2升高的动物研究中均得到证实。Lee YC等[27]研究也发现，使用抗氧化剂L-2-氧硫杂唑烷-4-羧酸(半胱氨酸前提物质)能引起NF-κB转位至细胞核总量及下游的调节因子如黏附分子、趋化因子和细胞因子表达显著降低，提示抗氧化剂在控制NF-κB转位和转录中均发挥重要作用。目前研究已发现，ROS能激活细胞内多条信号通路如NIK[28]、MAPKs[29]、PI3K/AKT[30]、TGF-β1激活 NF-κB，经磷酸化修饰作用增加下游TNF-a的表达。

TNF-a是一种内源性炎症介导子，参与免疫反应，在炎症反应中发挥重要作用。TNF-a主要通过与细胞表面受体肿瘤坏死因子受体 1(TNFR-1)结合发挥作用。经TNF-a结合的受体复合物可进一步募集肿瘤坏死因子相关死亡结构域(TRADD)、TRAF-2和RIP-1，激活MAPK、IκB激酶(IKK)和NADPH氧化酶等信号激酶[31]。其中IKK-NF-κB为细胞内经典的炎症信号通路，当细胞内TNF-a表达升高，可使IκBa Ser32和Ser36发生磷酸化降解，促使NF-κBp65被释放，转位至细胞核经修饰后与不同靶基因结合，增加相应炎症基因的表达。近年来研究已发现，NF-κB/RelA存在的可被磷酸化位点包括PKAc和MSK-1磷酸化Ser276，蛋白激酶 c磷酸化 Ser311，IKKβ磷酸化 Ser536。而Mohammad Jamaluddin等最新研究显示，阻断ROS信号通路可抑制 TNF-α介导的 NF-κ B/RelA Ser276磷酸化，而向细胞核转位的NF-κ B的含量保持不变，此外依赖于ROS且磷酸化RelA Ser276的激酶PKAc的活性显著降低，提示ROS信号通路并不影响IKK-NF-κ B转位过程，但对于 PKAc激酶磷酸化 NF-κ B/RelASer276过程中却起着必要的作用[32]。

由此可见，氧化应激通路和炎症通路彼此之间存在相互作用，结合本研究结果可以得知，有氧运动和Res能改善T2DM大鼠肝脏的氧化应激和炎症反应，可能通过减少因nSREBPs引起的脂质沉积，降低肝脏氧化应激，抑制NF-κBp65活性和转录，减少TNF-a水平最终改善肝脏炎症状态，其中两者联合较单一干预效果更为显著。此外，NF-κBp65通路上游存在非常重要的调节因子SIRT1，SIRT1是一种NAD+依赖的组蛋白脱乙酰化酶，在限热和Res条件下能显著被激活，对机体发挥多种有利效应[19]。细胞水平相关研究表明，Res能通过降低3T3-L1脂肪细胞中NF-κB的活性抑制TNF-a诱导的MCP-1启动子的活性[33]。肝脏特异性的敲除SIRT1基因能导致高脂饮食大鼠脂肪酸代谢紊乱，引起肝脏脂肪变性和炎症[34]，由此推测，作为细胞内一重要的能量平衡调节因子 SIRT1，可能参与7周有氧运动和Res干预后T2DM大鼠肝脏氧化应激和炎症改善过程，调节NF-κBp65介导的TNF-a，对此还有待我们进一步研究。

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