凝血酶受体激活肽对豚鼠心室肌细胞腺嘌呤核苷三磷酸敏感性钾通道的作用

赵宏飞，刘丽萍

腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）敏感性钾(KATP)通道是将细胞膜电活动与细胞代谢联系在一起的重要通道。心肌细胞上KATP通道和心肌梗死和心律失常的发生有密切关系[1]。KATP通道对心肌细胞有保护作用，对心脏疾病的治疗有重要意义。KATP参与心肌缺血预适应反应，增加心肌氧供,减少氧耗,改善心脏功能，改善心肌能量代谢,维持细胞正常结构等对心肌缺血的多种保护作用及其机制已得到阐明。对于凝血酶受体激活肽（TRAP），有研究表明其能通过促进血管再生，促进缺血创面愈合与表皮细胞增生、移行的作用[2]。TRAP能减少急性心肌梗死向室性心律失常的发展，为观察TRAP的该作用是否和KATP通道有关，本实验应用膜片钳单通道电流记录技术研究TRAP对豚鼠心室肌细胞KATP通道在保护心肌细胞方面的作用，探讨 TRAP对于心血管疾病的治疗有重要意义。

1 材料与方法

材料：2011-10至2012-12，健康成年豚鼠，体重250～350克，雌雄不限。吡那地尔（Pinacidil）、格列苯脲（Glibenclamide）、TRAP、胶原酶Ⅱ、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、小牛血清白蛋白(BSA)、腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP)均购自美国Sigma公司。

玻璃微电极的制备：本研究选用厚壁硬质玻璃（外径1.5 mm，壁厚0.5 mm）制备记录电极，经日本Narirshige公司的微电极拉制仪PP-830分两步垂直拉制而成。第一次拉制使毛细管中部主细拉长，直径约 200 µm，长度约 7～10 mm；第二次拉制将玻璃管拉断，尖端直径约 0.5～1.0 µm。

心肌细胞的分离：腹腔注射3 %戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，仰卧位固定，经颈静脉注射肝素150 U/kg，开胸，取出心脏，置于4℃有钙台氏液中，打开心包，修剪多余组织，游离主动脉根部，迅速挂上Langendorff装置，经主动脉行逆行灌流。先以有钙台氏液灌流，当心脏复跳后改灌无钙台式液，待心脏停跳 8～10 min后，用 50 ml无钙台式液（含胶原酶 II 5mg，BSA 6 mg）继续灌流，约20min左右当心脏呈现松软，颜色粉红时停止消化。剪下心室在心肌细胞保存液（KB）中剪碎，镊子夹入装有KB液的试管反复吹打后，吸去组织块，放入4 ℃稳定1小时后待用。实验过程中所有灌流液均需充氧饱和。整个灌流过程中不断用滴管润湿心脏，变换灌流液时更换滴管。灌流温度保持37 ℃，关闭门窗减少空气流动保证恒温。

单通道记录膜片钳技术：用Axon200B Patchclamp放大器记录豚鼠心室肌细胞KATP通道电流，同时输送到8道Bassel滤波器中0.2KHz的频率进行滤波处理及Axon interface做数字化处理。数字化后资料用膜片钳数据采集和分析软件pclamp 9.2进行记录、储存和分析。

实验步骤：实验分成5个部分，记录方式采取内面向外模式（第3部分实验除外），余为细胞黏附记录模式，均记录3次以上。① 记录豚鼠心室肌细胞KATP通道电流，在钳制电压分别为 0mV、 -20 mV、-40 mV、-60 mV、-80 mV、-100 mV时，记录电流30s以上，分别用clampfit 9.2软件和Gaussian方程计算出各个电压下的离子电流幅度。② 观察吡那地尔对KATP通道电流的作用：记录到KATP通道后，观察2 min，加入KATP通道激活剂吡那地尔，使浴槽中吡那地尔的浓度达到0.05 mmol/L。计算2min后电流开放几率，用通道活动度（通道开放概率与通道开放数的乘积）作为衡量通道活性大小的指标，它是与加药前进行自身对照。③ 观察ATP对KATP通道电流的作用： 在吡那地尔存在时，在形成细胞贴附式封接后，向上提起电极形成内面向外模式，记录到KATP通道电流后，加入ATP，使浴槽中ATP的浓度达到0.1 mmol/L。计算2 min后电流通道活动度，与加药前进行自身对照。④ 观察格列苯脲对KATP通道电流的作用：吡那地尔存在下，形成细胞贴附式封接后，向浴槽内加入格列苯脲，使浴槽中格列苯脲的浓度达到 0.1 mmol/L，计算2 min后电流通道活动度，与加药前进行自身对照。⑤ 观察TRAP(10 mmol/L)对心肌细胞KATP通道的作用：在吡那地尔存在时，实验中记录到KATP通道后观察2～3 min后再加入TRAP，分别计算通道活动度，加药前后分别比较。

2 结果

豚鼠心室肌细胞KATP通道电流的电流—电压曲线：在细胞黏附模式下，钳制电压为0 mV时，记录到电流，观察到该KATP通道电流的幅值随着电压的变化而变化：钳制电压是0 mV时，电流幅值是1.30 pA； 钳制电压是 -20 mV 时，电流幅值是 2.82 pA，钳制电压是-40 mV时，电流幅值是3.25 pA，钳制电压是-60 mV时，电流幅值是4.09 pA，钳制电压是-80 mV时，电流幅值是5.5 pA，钳制电压是-100 mV时，电流幅值是6.05 pA（图1）。随着膜的逐渐超极化，电流的幅值逐渐增加（图2）。根据豚鼠心室肌细胞KATP通道电流的电流—电压曲线，计算出反转电位（即当电流为0时的电压数值）为 32.28 mV。

图1 豚鼠心室肌细胞KATP通道电流的电流—电压曲线

图2 豚鼠心室肌细胞KATP通道的电流—电压曲线

吡那地尔对豚鼠心室肌细胞KATP通道电流的作用：钳制电压为0 mV时，加入吡那地尔后KATP通道的通道活动度为（0.55±0.07）比加药前（0.23±0.04）增加(记录5次)，差异有统计学意义（P＜0.01)。图3、4

图3 吡那地尔对豚鼠心室肌细胞KATP通道的影响

图4 吡那地尔对豚鼠心室肌细胞KATP通道的影响

ATP对豚鼠心室肌细胞KATP通道电流的作用：加入ATP后 KATP通道的通道活动度 （0.12±0.04）较加药前为（0.49±0.12）减少 (记录4次)，差异有统计学意义（P＜0.05 ）。图 5、6

格列苯脲对豚鼠心室肌细胞KATP通道电流的作用：加入格列苯脲后KATP通道的通道活动度为（0.06±0.03）较加入药物前（0.56±0.18）减少(记录5 次 )，差异有统计学意义（P＜0.05 ）。 图 7、8

图5 ATP（0.1mmol/L）对豚鼠心室肌细胞KATP通道的影响

图6 ATP（0.1 mmol/L）对豚鼠心室肌细胞KATP通道的影响

图7 格列苯脲（0.1 mmol/L）对豚鼠心室肌细胞KATP通道的影响

图8 格列苯脲对豚鼠心室细胞KATP通道的作用

TRAP对豚鼠心室肌细胞KATP通道的作用：加入 TRAP (10 mmol/L)后 KATP通道的通道活动度为（0.48±0.11）较加药前（0.15±0.11） 增加 (记录 5次 )，差异有统计学意义（P＜0.05)。 图 9、10

图9 TRAP对豚鼠心室肌细胞KATP通道的作用

图10 TRAP对豚鼠心室肌细胞KATP通道的作用

3 讨论

钾离子（K+）在机体的多种生命活动中起着非常重要的作用，但其功能的实现要依赖于细胞膜上的各种K+通道。K+通道是一类镶嵌于细胞膜脂质中的蛋白复合体家族，广泛存在于各种细胞，在不同的组织细胞中分别执行着各种重要的生理功能。

KATP通道是电压非依赖性的、配体门控通道，由Noma[1]于1983年首先在豚鼠的心肌细胞上发现。KATP的开放对心肌缺血和梗死时缩短动作电位的时程起到重要作用，对细胞外K+的聚集也有部分贡献[2,3]。心肌缺血缺氧时，KATP被激活，引起冠脉及其侧枝血管扩张，以增加缺血区血液供应。KATP开放产生负性肌力作用，缺血心肌收缩性能迅速降低，心肌耗氧量下降，从而保护心肌免遭更严重的缺血性损伤。KATP开放可促进细胞内ATP浓度增加，恢复细胞正常的能源供应，从而减轻缺血性损伤，维持细胞正常的功能和结构。KATP调节糖代谢，对抗缺血产生的能量代谢障碍。KATP开放能减少细胞内酶的泄漏，阻止膜磷脂缺失，保持细胞的超微结构[4]。缺血期此通道一定程度的开放有助于使心肌细胞进入“紧张” 防御状态。以前认为低氧和缺血激活KATP通道导致细胞内失K+，继而促进细胞内钙离子（Ca2+）超负荷和再灌注损伤。现在认为细胞内钠离子（Na+）的积累而并非KATP通道激活是失K+的主要原因。可罗卡林激活KATP，减少心肌K+含量，进而抑制Na+和Ca2+在心肌再灌注的蓄积，而发挥对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。因此，对心脏KATP通道的研究具有较高理论价值和应用前景。

吡那地尔为K+通道开放药，在临床上主要用于治疗高血压，使平滑肌细胞的K+通道开放，导致K+外流和静止膜电位负向转移，使静息时的细胞超极化，最后的效应是细胞内Ca2+减少和平滑肌松弛，外周血管扩张，阻力下降，从而使血压下降。已有研究[5]表明吡那地尔对缺血心肌有保护作用且KATP通道参与了心肌保护作用，为了进一步证实吡那地尔对心肌细胞的作用，本研究应用膜片钳单通道电流记录技术研究了吡那地尔对豚鼠心室肌细胞KATP通道的作用，我们得到吡那地尔能明显开放豚鼠心室肌细胞KATP通道，ATP和格列苯脲能抑制该作用。我们的实验结果支持了上两种观点。

临床上凝血酶常被用为治疗假性动脉瘤，瘤腔内注射凝血酶对机体凝血系统无明显影响[6,7]，凝血酶是与其受体结合后起作用。已有研究表明[8]凝血酶受体和急性心肌梗死后并发的心律失常有关系，并且凝血酶有助于急性心肌梗死发生时心电图上升高的ST段降低，降低心肌梗死带来的危害[9]。有研究表明TRAP能通过促进血管再生，促进缺血创面愈合与表皮细胞增生、移行的作用。本研究观察TRAP对心肌细胞KATP通道的作用发现TRAP可以使豚鼠心室肌细胞KATP通道开放几率增加。因此我们推断TRAP具有保护心肌免遭缺血性损伤，避免心肌梗死发生的作用。

本实验研究了TRAP能使心肌细胞KATP通道的开放概率增加，而KATP通道的开放能够引起冠脉及其侧枝血管扩张增加心肌血液供应，还能产生负性肌力作用,使心肌收缩性能降低，心肌耗氧量下降，从而保护心肌免遭缺血性损伤，避免心肌梗死的发生。因此通过本研究可以推断在心肌缺血缺氧时TRAP可以保护心脏免遭缺血性损伤，减少心脏事件的发生率，对于心血管疾病的治疗有重要意义。

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