高效液相色谱指纹图谱在熟地黄质量稳定性中的应用研究

高 森，李正翔，赵 鹏，王兵涛，房志仲，张彦文#(.天津医科大学总医院，天津 30005;.天津医科大学，天津 300070)

中药是我国传统中医中防病治病的载体，在中华民族五千余年的历史中写下了浓墨重彩的一笔［1］。地黄是中药中一味重要药材，传统中医认为，熟地黄味甘，性微温，具有滋阴补血，益精填髓之功效，具有广泛的用途，因此，地黄的内在质量直接关系到其疗效和应用安全［2］。中药是一种含有多种成分和化学物的复杂体系，指纹图谱广泛应用于其成分和产地分析以及药物的质量控制［3］。指纹图谱研究有多种方法，其中高效液相色谱(HPLC)指纹图谱技术具有高分离效能，是使用最为广泛的一种。因此，本研究采用HPLC指纹图谱对熟地黄质量稳定性进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器

LC-10A HPLC仪(日本岛津公司生产);戴安Pad检测仪;依利特Betasil色谱柱。

1.2 药品与试剂

选用清蒸和酒炖2种炮制方法加工的熟地黄各10批，地黄均来自同一生产基地的同一批次;乙腈和甲醇为色谱纯(购自天津市四有精细化学品有限公司);正丁醇，醋酸等。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

取粉末状熟地黄样品2 g，放入锥形瓶中(100 ml)，加入50 ml饱和水正丁醇溶液，盖紧塞子，放置过夜。用250 W、50 kHz的超声波处理并过滤，去除初滤液，量取30 ml并蒸干。所得残渣加溶于甲醇溶液中并移至容量瓶(50 ml)中，加至刻度。摇匀后过滤即得到样品。

2.2 色谱条件

流动相:乙腈-0.1%醋酸;柱温:25℃;流速:1 ml/min;进样量:5 μl，检测波长:300 nm;梯度洗脱。按照《中华人民共和国药典:一部》(2005年版)［4］中 HPLC试验进行，精密吸取供试品溶液5 μl，加入HPLC仪中测定。

2.3 试验质量控制

2.3.1 稳定性试验:取同一份供试品溶液，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h分别测定1次。结果表明各个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD为1.6%(RSD≤3%)，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.2 精密度试验:同一样品连续进样8次，结果表明各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD为2.6%(RSD≤3%)，试验精密度良好。

2.3.3 重复性试验:取样品8份，按照上述试验方法处理并分别检验，结果显示各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD为1.5%(RSD≤3%)，试验精密度良好。

2.4 HPLC指纹图谱的建立

2.4.1 熟地黄色谱图测定:取各供试品溶液，严格按照上述试验方法进行，记录所得色谱图，各色谱图的叠加图见图1、2。

2.4.2 共有模式图谱相似度分析:按以下要求建立指纹图谱:整体观察HPLC图谱峰，记录能够构成指纹图谱的色谱峰并记录相对应的峰号、峰数和峰位。比较所得到的所有批次的HPLC色谱图后，确定2种炮制方法的组成峰特征。清蒸熟地黄的共有峰有12个，酒炖熟地黄的共有峰有13个，这些共有峰构成了2种熟地黄的HPLC色谱指纹图谱。共有模式图谱的相似度使用相似度评价软件进行分析，结果见表1、2;各样品共有模式图见图3、4;10批清蒸熟地黄相似度的散点图见图5;10批酒炖熟地黄相似度的散点图见图6。

图1 清蒸熟地黄的色谱图叠加图Fig 1 Stacking chart of the fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in steam

图2 酒炖熟地黄的色谱图叠加图Fig 2 Stacking chart of the fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in wine stew

表1 清蒸熟地黄共有模式图谱相似度Tab 1 Resemblance of the mutual mode of HPLC fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in steam

表2 酒炖熟地黄共有模式图谱相似度Tab 2 Resemblance of the mutual mode of HPLC fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in wine stew

图3 清蒸熟地黄样品的共有模式图谱Fig 3 Mutual mode of HPLC fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in steam

图4 酒炖熟地黄样品的共有模式图谱Fig 4 mutual mode of HPLC fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in wine stew

图5 清蒸熟地黄相似度散点图Fig 5 Scatterplot of resemblance of the Prepared Rehmannia Root that processed in steam

图6 酒炖熟地黄相似度散点图Fig 6 Scatterplot of resemblance of the Prepared Rehmannia Root that processed in wine stew

3 结果

在观察实验所得的清蒸和酒炖熟地黄样品的各色谱图后发现，清蒸熟地黄样品的共有峰有12个，酒炖熟地黄样品的共有峰有13个，这些共有峰即为2种样品的特征组成峰，构成了清蒸熟地黄和酒炖熟地黄的HPLC指纹图谱的特征峰。

由表1、2可见，10批清蒸熟地黄指纹图谱相似度分别为0.979、0.988、0.982、0.983、0.944、0.900、0.847、0.859、0.989和0.822，只有7号，8号和10号样品的相似度低于0.9，说明清蒸熟地黄成分的一致性较好。10批酒炖熟地黄的相似度分别为 0.942、0.966、0.947、0.831、0.911、0.912、0933、0.988、0.945和0.984，只有4号样品的相似度低于0.9，说明酒炖熟地黄成分的一致性尚优于清蒸熟地黄，一致性较好。酒炖熟地黄样品的指纹图谱显示，在43～76 min内峰的相对比例较为稳定，体现了酒炖熟地黄的特征。由图5、6可见，清蒸熟地黄和酒炖熟地黄的相似度有较大区别。

由于熟地黄复杂的化学构成，使用其他方法指纹图谱难以建立。本研究中，运用HPLC指纹图谱法成功建立了样品的指纹图谱和指纹图谱的共有模式图谱，并且对2种样品的HPLC指纹图谱相似度进行了分析，最后得到以下结果:2种炮制方法不同的样品与各自的共有图谱相似度较高，说明产品质量较好。

4 讨论

由于中药的特殊性，其化学构成受多因素影响，比如生长环境、种植方式、气候条件、储藏方式、加工手段等。在这些因素的共同作用下造就了中药化学组成复杂的现状，指纹图谱法是一种利用现代技术分析复杂成分体系特征的技术［5］。

本研究采用HPLC指纹图谱法对熟地黄质量稳定性进行分析。实验结果显示清蒸熟地黄样品的共有峰有12个，酒炖熟地黄样品的共有峰有13个，这些共有峰构成了清蒸熟地黄和酒炖熟地黄的HPLC指纹图谱的特征峰。10批清蒸熟地黄指纹图谱相似度除了7号、8号和10号样品外均高于0.9，说明清蒸熟地黄成分的一致性较好。10批酒炖熟地黄指纹图谱相似度只有4号样品的相似度低于0.9，且在43～76 min内峰的相对比例较为稳定，体现了酒炖熟地黄的特征。由图5、6可见，清蒸熟地黄和酒炖熟地黄的相似度有较大区别，这是由于不同加工方式所致。由于药材易受生长环境等因素的影响，即使采用同一批次的药材，其内部化学组成也具有一定的差异。这在本研究RSD计算中得以体现，本研究中所得RSD均＜3%，差异影响不大。

以上研究表明，HPLC指纹图谱技术是研究熟地黄质量稳定性的有效手段。

［1］张礼菊.色谱指纹图谱在中药质量标准体系中的应用［J］.安徽医药，2009，13(11):1414-1417.

［2］白雁，雷敬卫.液相色谱指纹图谱在熟地黄质量稳定性中的应用研究［J］.河南师范大学学报:自然科学版，2008，36(5):89-92.

［3］胡燕，王文波，宋力飞，等.红花 HPLC指纹图谱研究［J］.湖南中医杂志，2013，29(3):110-112.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2005:141.

［5］曹建军，梁宗锁，杨东风，等.应用HPLC指纹图谱技术确定熟地黄炮制终点［J］.中国中药杂志，2010，35(19):2556-2560.