全反式维A酸给药4周对大鼠的毒性作用

陈雁虹，盖仁华，吴洪海

(浙江大学1.实验动物中心，2.药物安全评价研究中心，浙江杭州 310058)

全反式维A酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是维生素A的一种代谢衍生物，对细胞增殖、分化和成熟具有调节作用[1]，是维持机体正常生长发育和各种生理活动必不可少的重要物质。由于能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡，ATRA被广泛用于治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[2]，目前临床已尝试用于实体瘤的治疗[3]。但在临床应用中发现，ATRA会引起被称为维A酸综合征的皮肤干燥、口唇干裂、头痛、肌肉骨骼疼痛等[4]。骨髓抑制坏死[5]和肝毒性等不良反应，亦有导致高甘油三酯血症的报道[6]。本研究通过观察大鼠连续4周ig给予ATRA的长期毒性反应，初步确定其主要毒性靶器官及毒性反应性质和程度，为临床用药的安全性提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

ATRA由陕西森弗生物技术有限公司提供，批号:20090514，纯度99.6%，避光保存于 －20℃，使用前用0.5%羧甲纤维素钠(CMC-Na)溶液配制成混悬均匀溶液。CMC-Na和EDTA-K2购自国药集团化学试剂有限公司，批号:30036328。生化试剂盒购自德国罗氏诊断有限公司。凝血试剂盒购自德国西门子医学诊断产品有限公司。全血细胞计数试剂包购自北京西门子医疗诊断设备有限公司。肝素钠购自BioSharp公司。甲醛和二甲苯等试剂购自上海申翔化学试剂有限公司。

1.2 仪器

Cobas C311全自动生化仪(德国罗氏公司);CA-550全自动血凝分析仪(日本Sysmex医用电子有限公司);ADVIA 2120全自动五分类血细胞分析仪(德国Siemens医疗系统集团);5424离心机(德国Eppendorf股份公司);AL104电子天平(上海Metler Toledo仪器有限公司)。EG1150H石蜡包埋机、RM2235组织切片机、ASP300组织脱水机和DM4000电子显微镜(德国Leica仪器有限公司)。

1.3 大鼠

SPF级 SD大鼠80只，雌雄各半，体质量160～180 g。由浙江省实验大鼠中心提供，动物生产许可证号:SCXK(浙)20080033，动物使用许可证号:SYXK(浙)2003-0098，温度20～24℃，湿度40%～70%，明暗交替12 h/12 h，换气次数为10～20 h－1，大鼠自由饮水、摄食。

1.4 分组和给药

SD大鼠80只，按体质量随机分为4组，分别为溶剂对照组，ATRA 10，50 和 250 mg·kg－1组，每组20只，雌雄各半。大鼠每日上午 ig给予ATRA，给药容积为 10 ml·kg－1，每天 1 次，连续4周。溶剂对照组给予同等体积0.5%CMC-Na溶液。

1.5 给药期间对大鼠的观察

给药期间每日对大鼠的行为体征、饮食、粪便、呼吸和自发活动等一般状况进行观察;每7 d称量1次体质量和摄食量。

1.6 血液血常规、血液生化和凝血功能检查

停药后第1天和第15天，ATRA和溶剂对照组大鼠禁食12 h后，分别取部分大鼠，雌雄各半，10%水合氯醛麻醉后腹主动脉采血，进行血常规、血液生化和凝血功能检测。

1.7 脏器系数计算和病理组织学的检查

停药后第1天和第15天分别进行大鼠尸检后，取对心、肝、脾、肺和肾等主要脏器进行称量，计算其脏器系数=脏器质量(g)/体质量(g)×100。各脏器用10%中性甲醛溶液固定，进行常规病理取材、制片和HE染色，显微镜下进行病理组织学检查。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 ATRA对大鼠一般状况的影响

ATRA 250 mg·kg－1组给药 14 d 后，大鼠出现毛色黯淡、竖毛、眼睑部脱毛出血和呼吸急促等症状，四肢出现不同程度的骨折现象，自主活动明显减少;给药18 d后出现大鼠死亡，至给药期结束，大鼠有4只死亡，且都为雄性。ATRA 10和50 mg·kg－1组毛色、自主活动和体征反应等均无异常，未出现大鼠死亡。

2.2 ATRA对大鼠体质量和摄食量的影响

如表1和表2所示，ATRA 250 mg·kg－1组给药1周后体质量逐渐减轻，与溶剂对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，ATRA 10 和 50 mg·kg－1组体质量增长较为缓慢，ATRA 50 mg·kg－1组第2周与溶剂对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，其余组与对照组无显著性差异。同时与溶剂对照组比较，ATRA 250 mg·kg－1组摄食量逐渐减少(P＜0.05)，ATRA 10 和 250 mg·kg－1组摄食量无明显变化。

Tab.1 Effect of all-trans retinoic acid(ATRA)on body mass of rats

Tab.2 Effect of ATRA on food intake in rats

2.3 ATRA对血常规指标的影响

如表3所示，停药后第1天，各组大鼠白细胞计数均较溶剂对照组有升高的趋势;ATRA 250 mg·kg－1组中性粒细胞、单核细胞和网织红细胞明显升高，嗜酸性粒细胞、红细胞、血红蛋白浓度、红细胞压积和血小板数明显降低(P＜0.01);ATRA 10和50 mg·kg－1组中性粒细胞明显升高(P＜0.05);ATRA 50 mg·kg－1组红细胞、血红蛋白浓度、红细胞压积和血小板数明显降低，网织红细胞明显升高(P＜0.01);ATRA 10 mg·kg－1组红细胞、血红蛋白浓度、红细胞压积明显降低(P＜0.01)，网织红细胞明显升高(P＜0.05)。其中，ATRA对红细胞、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板、网织红细胞的影响存在一定的剂量依赖性。停药后第15天，ATRA各组大鼠中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞压积和血小板有不同程度的恢复，而较溶剂对照组，ATRA 250 mg·kg－1组白细胞、淋巴细胞、红细胞、血红蛋白浓度仍有明显的降低，网织红细胞有明显的升高(P＜0.01);ATRA 50 mg·kg－1组白细胞、淋巴细胞有明显的降低，网织红细胞有明显的升高(P＜0.01);ATRA 10 mg·kg－1组白细胞、淋巴细胞和血红蛋白浓度明显降低(P＜0.01)。

2.4 ATRA对血生化指标的影响

如表4所示，停药后第1天，与溶剂对照组比较，ATRA 250 mg·kg－1组总蛋白、白蛋白、总胆红素和肌酐明显下降，球蛋白、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和甘油三酯明显上升(P＜0.01)，同时葡萄糖明显升高，肌酸激酶明显降低(P＜0.05)。ATRA 50 mg·kg－1组白蛋白和肌酸激酶明显降低，球蛋白、天冬氨酸转氨酶和甘油三酯明显上升(P＜0.01)，总蛋白和总胆红素明显降低(P＜0.05)。ATRA 10 mg·kg－1组白蛋白明显降低，天冬氨酸转氨酶、葡萄糖和甘油三酯明显上升(P＜0.01)，总蛋白和肌酐降低(P＜0.05)，血清总胆固醇有升高(P＜0.05)。其中，ATRA对总蛋白、白蛋白、球蛋白、丙氨酸转氨酶、总胆红素、天冬氨酸转氨酶、肌酐和甘油三酯的影响存在一定的剂量依赖性。其他生化指标包括电解质指标与溶剂对照组比较无显著性差异。停药后第15天，与溶剂对照组比较，ATRA 250 mg·kg－1组天冬氨酸转氨酶明显上升，肌酐和葡萄糖明显降低(P＜0.01)，但均较停药后第1天有所恢复;与溶剂对照组相比，ATRA 10和50 mg·kg－1组血清总胆固醇明显降低(P＜0.01，P＜0.05)。其余各项指标均有不同程度的恢复，与溶剂对照组比较无显著性差异。

Tab.3 Effect of ATRA on blood routine in rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

Tab.4 Effect of ATRA on parameters of blood biochemistry in rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

2.5 ATRA对凝血指标的影响

如表5所示，停药后第1天，ATRA 250 mg·kg－1组血浆凝血酶原时间(prothrombin time，PT)和国际标准化比值(international normalized ratio，INR)明显延长，凝血酶时间(thrombin time，TT)明显减少(P＜0.05)。ATRA 50 mg·kg－1组 PT，INR 和活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)明显延长(P＜0.01)，TT 明显减少(P＜0.05)。ATRA 10 mg·kg－1组 PT，INR 和APTT明显延长(P＜0.01)。停药后第15天，ATRA 10，50和250 mg·kg－1组PT，TT，INR和APTT 等凝血指标与溶剂对照组比较均无显著性差异。

2.6 ATRA对脏器系数的影响

如表6所示，停药后第1天，与溶剂对照组比较，ATRA 250 mg·kg－1组心、肝、脾、肺、肾和肾上腺的脏器系数明显升高(P＜0.01)，胸腺脏器系数明显降低(P＜0.01)。ATRA 50 mg·kg－1组肝和脾的脏器系数明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。与溶剂对照组比较，ATRA 10 mg·kg－1组肝脏器系数明显升高(P＜0.01)。停药后第 15天，ATRA 250 mg·kg－1组心、肝、脾、肺、肾和肾上腺的脏器系数仍较溶剂对照组明显升高(P＜0.01)，ATRA 10和50 mg·kg－1各脏器系数均有所恢复，与溶剂对照组无明显差异。

Tab.5 Effect of ATRA on parameters of blood coagulation of rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

Tab.6 Effect of ATRA on organ index on 1st and 15th day after drug withdrawal

2.7 ATRA对脏器病理组织学的影响

停药后第1天，显微镜观察发现，ATRA 50和250 mg·kg－1组大鼠出现肝髓外造血(图 1C，D);ATRA 250 mg·kg－1组出现肝细胞水肿(图 1D);ATRA 250 mg·kg－1组出现十二指肠上皮细胞变性、坏死(图2D);ATRA 10，50 和250 mg·kg－1组均出现脾巨核细胞增多(图3B～D);ATRA 250 mg·kg－1组胸腺皮质细胞减少(图 4D);生殖系统组织病理改变主要表现为ATRA 50和250 mg·kg－1组大鼠睾丸曲精细管萎缩和生精细胞减少(图 5C，D)，ATRA 250 mg·kg－1组附睾管腔内精子减少并伴有间质水肿(图6D)。此外还发现骨骼出现纤维组织增生，类骨组织和骨小梁增生现象，部分大鼠毛囊减少。停药后第15天，ATRA 10，50和250 mg·kg－1组仍存在脾巨核细胞增多，ATRA 250 mg·kg－1组5/8只大鼠睾丸出现中度曲精细管萎缩、生精细胞减少，2/8只大鼠出现毛囊减少，其他脏器整体病理改变较给药期有所恢复(图略)。

Fig.1 Effect of ATRA on liver histopathological changes in rats(HE).See Tab.1 for rat treatment.The rats were sacrificed on the 1st day after drug withdrawal.The yellow arrow refers to liver cells steatosis while the green arrow refers to liver cells edema and the blue arrow refers to extramedullary hematopoiesis.A:solvent control;B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.2 Effect of ATRA on duodenum histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to duodenal epithelium cells degeneration and necrosis.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg －1，respectively.

Fig.3 Effect of ATRA on spleen histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to megakaryocytes.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.4 Effect of ATRA on thymus histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to thymus cortical cells reduced.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 150 mg·kg－1，respectively.

Fig.5 Effect of ATRA on testis histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to seminiferous tubular atrophy and spermatogenic cells decreased.A:solvent control;B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.6 Effect of ATRA on epididymis histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to the reduction of sperm within the epididymis lumen while the blue arrow refers to interstitial edema.A:solvent control;B－D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1group，respectively.

3 讨论

本研究结果显示，口服ATRA大鼠的红细胞数、血小板数和血红蛋白含量明显低于正常值，并有剂量依赖性毒性反应关系，说明ATRA能造成大鼠不同程度的血小板减少症和贫血症，同时存在一定的粒系增生和骨髓抑制现象。病理结果显示大鼠肝和生殖系统有损伤。睾丸曲精细管萎缩、生精细胞减少提示ATRA可能对雄性生殖系统有一定的毒性作用。

本研究发现，ATRA诱导分化的ALP细胞分泌白细胞介素1β(IL-1β)，IL-6，IL-8和肿瘤坏死因子α等血管活性细胞因子，进而促进白细胞活化[6]。同时ATRA能够抑制体内IL-2基因表达和T细胞活性[7]。这些细胞因子的变化可能是发生维A酸综合征的原因。

ATRA 250 mg·kg－1组大鼠出现呼吸急促可能与APL-ATRA细胞浸润大鼠肺组织有关。周晋等[8]用微重力旋转培养法体外模拟维A酸综合征，发现APLATRA细胞浸润人肺组织的分子机制可能与CXCR4和SDF-1α的高表达有关。徐娟等[9]对APL患者的细胞黏附分子表达进行动态监测，发现CD11b的大量表达与维A酸综合征有密切关系。CD11b的表达速度过于同步化，使得大量表达黏附分子白血病细胞滞留与肺循环，导致严重的通气功能障碍。

本研究病理结果显示，给药组大鼠出现髓外造血和脾巨核细胞增多，可能是由于红细胞数和血小板数下降机体的代偿反应，同时ATRA能够抑制巨核细胞，造成巨核细胞成熟障碍而不能正常制造血小板，引起血小板减少。ATRA组总蛋白偏低，两种转氨酶、碱性磷酸酶、葡萄糖与甘油三酯偏高，同时出现肝细胞水肿，说明ATRA能导致大鼠肝功能受损，并可能导致血糖升高和高甘油三酯血症。亦有ATRA临床致高甘油三酯血症的报道[10]。病理研究结果显示，纤维组织增生、类骨组织和骨小梁增生现象与骨折的判断吻合。ATRA为公认的致畸物，可以导致大小鼠、仓鼠和兔等多种实验动物胚胎畸形，机制与ATRA抑制Smad2和Smad3的磷酸化有关[11－13]。以上毒性作用与临床所见个别患者的不良反应存在一致性，可为临床用药不良反应监测提供参考。更多的毒理机制有待进一步研究。

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