响应面分析法优化重组原动蛋白2β 诱导条件的研究

张小锋

响应面分析法(RSM)是一种基于响应变量与输入变量关联性研究的函数关系，也是一种工艺优化的有效方法［1］，目前被广泛应用于食品、生物、化工、农业等多个领域，并获得了较好效果［2］。原动蛋白2 具有生物节律传递性、神经元迁移影响性、促进胃肠道平滑肌收缩等作用。原动蛋白2 在基因转录过程中经可变剪接的mRNA 翻译后加工处理可形成一种衍生蛋白质因子，称为“原动蛋白2β(PK2β)”。目前生物学对于PK2β 的研究内容不多，本研究主要采用RSM 方法对重组PK2β 的诱导条件及影响因素进行研究和探讨，为基因生物学蛋白质制备等提供有效依据。报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料Luria-Bertani(LB)培养基配置:10 g/L 胰蛋白胨(Tryptone)，10 g/L 氯化钠(NaCl)，5 g/L 酵母提取物(Yeast extract)，并利用NaOH 将培养基溶液的pH 值调整至7.4［3］。溴酚蓝由北京精益精化工有限有责任公司提供。考马斯亮蓝由上海沪宇生物有限公司提供。卡那霉素由四川方向药业有限责任公司提供。IPTG 由武汉鸿雨新科技有限公司提供。丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺均选用超级纯纯度，由上海生工生物工程有限公司提供。冰醋酸、过硫酸铵、乙醇等均选用分析纯纯度，由南京化学试剂有限公司提供。PK2β 表达重组菌株E.coli BL21(DE3)由上海浩然生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 诱导方法:LB 培养基30 ml 加入卡那霉素，重组菌株E.coli BL21(DE3)取3 μl 冻存液接种于培养基上，转入220 r/min转速和37℃恒温条件下的电动机中过夜。以0.1%的比例将培养后的种子菌液接种于LB 培养基，同样220 r/min转速和37℃恒温条件下培养，测定OD600 达到设定值时，将IPTG 加入种子菌液中，诱导PK2β 表达重组。

1.2.2 分析软件:PK2β 表达量采用光密度扫描法检测，采用Quantity one v4.62 生物图像处理软件进行定量分析，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析采用北京伯乐生命科学工作者发展有限公司提供的Mini-Protean 3 电泳系统。

1.2.3 观察指标:采用单因素分析方法。先对诱导时机和诱导物浓度进行固定，变动诱导时间，分析诱导时间与PK2β 表达量的关联性;再对诱导时间和诱导物浓度进行固定，变动诱导时机，分析诱导时机与PK2β 表达量的关联性;最后对诱导时间与诱导时机进行固定，变动诱导物浓度，分析诱导物浓度与PK2β 表达量的关联性。根据单因素分析结果对诱导条件进行关系优化，将三种因素各取3 个高水平点值，采用回归方程进行响应面分析。方程表示为［4，5］:

式中，Yi 表示预测响应值，Xi 表示三大因素的水平值，i=1为诱导时间，i=2 为诱导时机，i=3 为诱导物浓度，βi、βij、β0分别表示线性偏移项、二阶偏移项和偏移项。

2 结果

2.1 诱导时间 固定诱导时机OD600 为0.6，诱导物浓度为1 mmol/L，变动诱导时间设置为1 ～9 h，每间隔1 h 进行1 次测定和记录。具体测定PK2β 表达量随着诱时间的延长，PK2β表达量逐渐上升并趋于平缓;其中6 h 时为峰值，为最佳诱导时间;4 ～9 h 曲线平稳，为最佳诱导时间段。见图1。

图1 不同诱导时间下单因素PK2β 表达量变化趋势图

2.2 诱导时机固定诱导时间为6 h，诱导物浓度为1 mmol/L，变动诱导时机OD600 为0.1 ～0.9，每间隔0.1 进行1 次测定和记录。具体测定PK2β 表达量随着诱导时机的变化，PK2β 表达量上升至峰值又呈现下降趋势;其中OD600 为0.4 时为峰值，为最佳诱导时机;OD600 为0.3 ～0.8 时，PK2β表达量相对较高，为最佳诱导时机。见图2。

图2 不同诱导时机下单因素PK2β 表达量变化趋势图

2.3 诱导物浓度固定诱导时间为6 h，诱导时机OD600 为0.4，变 动 诱 导 物 浓 度 设 置 为0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5 mmol/L。具体测定PK2β 表达量随着诱导物浓度的提升，PK2β 表达量先上升然后趋于平稳;0.5 ～5 mmol/L 为最佳诱导物浓度范围。见图3。

图3 不同诱导物浓度下单因素PK2β 表达量变化趋势图

2.4 响应面分析响应面分析结果显示，诱导时间为7 h、诱导时机OD600 为0.5、诱导物浓度为0.1 mmol/L 时，重组PK2β表达量为最优。

3 讨论

随着我国医疗事业的不断发展与发达，对疾病的治疗与预防已经逐渐深入到生物学、分子学领域。基因工程又被称为“DNA 重组技术”，是通过将不同来源的基因在体外进行重组与拼接而形成杂种DNA 分子，再导入到活细胞中，从而获得更加优质的生物遗传因子，生产新品种［6，7］。基因工程技术在对重组蛋白质进行表达时，表达效果受到载体、宿主菌体、目的基因、诱导条件等影响，而诱导条件主要包括诱导时间、诱导时机和诱导物浓度。

但是，基因工程菌表达重组蛋白时可能对其它蛋白的表达产生影响和干扰，从而影响细胞自身代谢能力及细胞生长与增殖能力，因而研究和探讨重组蛋白的最佳条件具有重要意义。一方面使菌体个体呈现良好的生理状态，另一方面也使菌群整体处于高密度、高生长状态，从而尽可能高的获得重组蛋白的表达。

诱导时间的延长可以使菌体内部积累起更大含量的重组蛋白，然而，当积累时间过长时，易对量产的效率产生影响，而且一些菌体可能因自溶造成重组蛋白的胞内损失。在本组研究中我们发现，在诱导时机与诱导物浓度不变的情况下，随着诱导时间的延长，PK2β 表达量初期上升并逐渐趋于平稳，且在6 h 达到最佳的诱导时间。诱导时机不可过早或过晚，过早可能使菌的总体密度尚未达到理想值时即开始进行蛋白的表达重组，加大了菌体的代谢负担，影响增殖;而时机若过晚，则菌的个体生理状态达不到良好效果，从而降低了单位蛋白的表达重组水平，对于整体的表达水平提升产生影响。本组研究中，在诱导时间和诱导物浓度不变的情况下，随着诱导时机的发展，PK2β 表达量逐步上升至峰值，再逐渐下降，而OD600 为0.3 ～0.8时，PK2β 表达量相对较高，为最佳诱导时机。诱导物浓度的高低影响了其诱导效率，用量不足，无法发挥对蛋白表达重组的启动作用，影响蛋白水平的高表达;而用量过高则引起过度表达而影响整体密度，也达不到较好的重组蛋白表达水平。本组研究中，在诱导时间与诱导时机不变的情况下，随着诱导物浓度的增加，PK2β 表达量快速上升后趋于平稳，而0.5～5 mmol/L 为最佳诱导物浓度范围。

当然，为了进一步了解三种因素的相关性，以便于在实践过程中通过三种诱导条件的有效配比来实现最佳的PK2β 表达量，本组研究还采用了RSM，利用回归方程将诱导时间、诱导时机和诱导物浓度结合起来［8］，最终获得结论:诱导时间为7 h、诱导时机OD600 为0.5、诱导物浓度为0.1 mmol/L时，重组PK2β 表达量为最优。

1 魏娜，罗敏，曾一梅，等.响应面法优化重组工程菌的发酵工艺条件.生物技术，2010，20:69-72.

2 Choi J，Lee PC，Kim JH，et al.FM-P33 Medium optimization for the production of astaxanthin by paracoccussp using response surface methodology.J Biosci Bioeng，2009，108(Suppl 1):129-132.

3 陈魁主编.试验设计与分析.第5 版.北京:清华大学出版社，2008.94-98.

4 刘斌，郭红丽，钮小松，等.基因重组酵母工程菌优化表达人源泉胶原蛋白.南京理工大学学报，2011，35:558-560.

5 杜少平，梁淑娃，杨冠东，等.响应面法优化两歧双歧杆菌发酵培养基.生物技术通报，2008，24 增刊:431-435.

6 苗猛猛，王旭静，唐巧玲，等.抗蚜基因工程研究进展.生物技术进展，2012，2:104-108.

7 盖树鹏.基因工程实践教学改革的探索.科技信息，2012，5:18-20.

8 熊春红，彭康年，谢明勇.响应面法优化超声辅助提取原子荧光法快速测定茶叶痕量汞.光谱学与光谱分析，2011，31:2843-2846.