壳聚糖固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶

尹春丽， 陶贵荣， 许 乐， 牛卫宁*

（1.西安文理学院 生命科学系，陕西 西安710065；2.西北工业大学 生命学院，陕西 西安 710072）

S-腺苷甲硫氨酸合成酶 （S-adenosylmethionine synthetase）在体内催化三磷酸腺苷和L-甲硫氨酸合成 S-腺苷甲硫氨酸 （S-adenosylmethionine，SAM）[1]，在欧美国家SAM已作为食品营养强化剂、保健品以及药品而得到广泛应用[2]，但SAM售价昂贵。因此，建立廉价高效的SAM生产方法是其大规模推广应用的关键。目前，SAM的生产方法主要为酵母菌发酵法，菌种主要包括野生或者诱变的酿酒酵母，以及经过遗传改造的重组毕赤酵母，尽管发酵法SAM产量可以超过10 g/L[3-4]，但存在生产周期长、底物转化率低、纯化工艺复杂、能耗高等不足[5]。体外酶促转化法克服了发酵法的不足，同时生产成本较低，因而是较为有效的工业化生产方法。许多研究者对来源于酿酒酵母以及大肠杆菌的重组SAM合成酶的催化特性进行了研究，但是存在SAM合成酶活性低、游离酶酶稳定性差，以及无法回收重复利用的问题[6-8]。作者所在研究组前期构建了高效组成型表达SAM合成酶的重组大肠杆菌E.Coli JM109（pBR322-SAMS），重组菌SAM合成酶活性比原始菌提高了157倍，并对其酶学性质进行了研究[9-10]。

与游离酶相比，固定化酶能大大提高催化反应过程中酶的稳定性。同时，固定化酶与反应液可以通过离心或过滤等简单方式加以分离，有利于酶的多次重复使用及反应产物的纯化，更适于在工业生产中使用。Luo等[11]将来源于酿酒酵母的SAM合成酶通过亲和层析固定在Ni离子螯和柱上，经过3次连续反应，固定化酶活力回收率仅为39.5%，该研究使用的固定化树脂昂贵，不利于大规模生产，而且固定化酶的活性回收率以及稳定性并不理想。作者所在研究组通过海藻酸钠包埋法固定化腺苷蛋氨酸合成酶，但是固定化酶活性回收率仅有42%，并且存在固定化酶在反应过程中强度不高以及酶容易流失等问题[12]。壳聚糖是一种富含氨基的天然高分子化合物，因其生物相容性、较好的机械性能、稳定的化学性质而成为固定化酶的优良载体，通过戊二醛交联形成化学键将酶固定在壳聚糖微球上，可以防止催化过程中酶的流失。另外，作者所在研究组通过全细胞催化和固定化酶催化合成SAM的技术方法已经获得了专利授权[13]。

作者以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，对SAM合成酶进行固定化，分别对酶固定化条件以及固定化酶的性质进行了研究，为工业化应用固定化酶高效生产SAM奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种和试剂

重组大肠杆菌菌株 E.coli JM109（pBR322-SAMS）为作者所在实验室构建并保存[14]，Phenyl-Sepharose Fast Flow预装柱购于GE公司，SAM标准品购于 Sigma公司，壳聚糖（相对分子质量 6×105Da，脱乙酰度大于80%）购于国药集团化学试剂有限公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组SAM合成酶的表达和粗酶液制备 将重组菌 E.coliJM109（pBR322-SAMS）接种到 1 L含有15 μg/mL四环素的LB培养基中，30℃220 r/min培养12～16 h，然后离心收获菌体备用。重组SAM合成酶的纯化主要参照文献[12]进行，纯化过程如下：离心1 L培养液收集细胞，然后用40 mL裂解液 （100 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA-Na2，pH 8.0）在冰水浴中超声 （300 W，超声 3 s，间隔 5 s）处理12 min破碎细胞，破碎液加入 （NH4）2SO4固体粉末至终浓度为0.75 mol/L，10 000 r/min离心20 min，上清液通过0.22 μm的滤膜过滤备用。将上述酶液加入经 Buffer A （Tris-HCl 50 mmol/L，（NH4）2SO40.75 mol/L，pH 8.0）预平衡的 Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，然后使用 Buffer B（Tris-HCl 50 mmol/L，pH 8.0）洗脱，收集酶液用于固定化酶制备。

1.2.2 SAM合成酶固定化方法 称取一定质量的壳聚糖充分溶解于100 mL φ（乙酸）=2%的水溶液中，使用6号针头注射器将该溶液逐滴加入到2 mol/L的NaOH水溶液中，壳聚糖溶液凝聚成直径约为2 mm的白色微球，过滤收集并用蒸馏水洗涤至中性，然后在壳聚糖微球中加入不同体积分数的戊二醛水溶液，室温振荡交联5 h后用Tris-HCl缓冲液 （pH 8.0）洗涤交联载体，然后加入适量的SAM合成酶液于4℃吸附交联12 h，洗净抽滤干燥后得到固定化酶，固定化酶密封保存于4℃。固定化酶的活力与固定化时所加游离酶总活力的比值即为固定化酶的活力回收率。

1.2.3 酶活性测定方法 固定化酶以及游离酶活性测定参照文献[10]方法进行，使用SAM标准品制作色谱峰峰面积和SAM质量浓度之间的标准曲线，计算样品中SAM的质量浓度。酶活力单位定义为：37℃，1 h催化形成1 μmol SAM所需要的酶量为1个活力单位（1 U）。

1.2.4 固定化酶催化合成SAM 用天平称取经抽滤干燥的1 g固定化酶加到10 mL SAM合成反应液 （100 mmol/L Tris、100 mmol/L KCl、70 mmol/L MgSO4、40 mmol/L L-Met、30 mmol/L ATP、0.8 mol/L对甲基苯磺酸钠，pH 7.0）中，35℃振荡反应8 h，收集上清液进行HPLC分析。每次反应后，将固定化酶过滤洗涤后重复使用。

2 结果与讨论

2.1 固定化条件的优化

通过重组大肠杆菌组成型表达SAM合成酶，然后经过硫酸铵沉淀和疏水层析纯化得到单位酶活为22 U/mg的SAM合成酶，结果如图1所示，并将其用于后续的固定化酶研究。

2.1.1 壳聚糖微球的制备 壳聚糖溶液浓度能显著影响壳聚糖成球性能。研究中首先考察了质量浓度为1～5 g/dL壳聚糖溶液在2 mol/L的NaOH凝结液中的成球情况，结果表明：当壳聚糖质量小于2 g/dL的时候，壳聚糖黏度较小，成球容易，但是小球机械强度较差，在合成SAM的反应液中易溶胀和破碎；当壳聚糖质量浓度大于3 g/dL的时候，壳聚糖溶液成球困难。因此采用质量浓度为2.5 g/dL壳聚糖溶液来制备壳聚糖微球。

2.1.2 戊二醛浓度对酶固定化的影响 平行取0.5 g壳聚糖微球，然后分别加入不同浓度的戊二醛水溶液5 mL，于室温振荡交联5 h，抽滤洗涤。然后加入2 mL SAM酶液（2 mg/mL）于4℃交联12 h，洗净抽滤后得到固定化酶，测定固定化酶的活力。结果如图2所示，当戊二醛体积分数为0.8%时，酶活力达到最大。当戊二醛含量较低时，载体表面偶联的醛基不足，最终固定的酶量较少，导致固定化酶活性较低；当戊二醛含量过高时，可导致蛋白质变性，同时载体结合过多的酶也增加了酶的空间位阻，使固定化酶的活力下降。由此可以确定戊二醛最佳体积分数为0.8%。

图1 SAM合成酶纯化结果的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of SAM synthetase purification

图2 戊二醛体积分数对固定化酶的影响Fig.2 Effect of the concentration of glutaraldehyde on the immobilized enzyme

2.1.3 酶与载体配比对固定化的影响 平行取0.5 g壳聚糖微球与φ（戊二醛）=0.8%的水溶液交联制备的载体，各加入不同量的酶液进行固定化，测定固定化酶活力，结果如图3所示。随着给酶量的增加，固定化酶活力逐渐增加。当酶量增加到6 mg/mL时，固定化酶活力达到最大值。继续增加酶量，固定化酶活力不再增加，并且有略微下降的趋势，这是由于载体的结合位点已经达到饱和。因此确定1 mL凝胶添加6 mg SAM合成酶为最佳。

图3 酶与凝胶配比对固定化酶的影响Fig.3 Effect of enzyme/chitosan gel ratio on the immobilized enzyme

2.1.4 交联时间对酶固定化的影响 为了减少酶交联过程中活性的损失，载体和酶的交联反应在4℃下进行。交联时间对固定化酶活力的影响如图4所示。固定化酶活力随着酶交联时间增加而增大，12 h达到最高后则略微下降，酶交联时间越长越有利于酶分子固定在载体上，但当载体偶联的酶过多时，可能使载体孔径相应变小，导致底物和产物的传质性降低，从而使酶活力下降。

图4 酶交联时间对固定化酶活力的影响Fig.4 Effect of cross-linking time on the immobilized enzyme

在以上优化条件下，所得固定化酶活性回收率为76%。

2.2 固定化SAM合成酶的性质

2.2.1 固定化酶的热稳定性 将固定化酶和游离酶分别在不同温度下保温5 h后测定残留酶活力，分别以未经过热处理的固定化酶和游离酶的酶活力为100%，结果如图5所示。固定化酶的热稳定性比游离酶明显提高，固定化酶在55℃下保温5 h后仍保持了53%的活力，而游离酶在50℃下保温5 h，活力完全丧失。另外，作者所在研究组前期通过海藻酸钠包埋法制备了固定化SAM合成酶，在55℃下保温5 h后保持了32%的活力[12]，因此通过壳聚糖交联法制备的固定化酶热稳定性高于海藻酸钠包埋法制备的固定化酶。这可能是由于SAM合成酶被戊二醛交联固定化后增加了酶分子的稳定性，使分子整体运动受限，酶的热稳定性也随之增加。

图5 固定化和游离SAM合成酶的热稳定性Fig.5 Thermal stability of immobilized and free SAM synthetase

2.2.2 pH对固定化酶活力的影响 将固定化酶和游离酶置于pH 6～9.5的缓冲液中4℃放置10 h测定酶活性，结果如图6所示，在更广泛的pH范围内固定化酶比游离酶的稳定性增强，特别是在pH＞7.5的碱性条件下固定化酶的稳定性得到大幅度提高。在pH 7.5～9.0的缓冲液中4℃保温10 h酶活性仍保留80%以上，可能是酶经过交联后被固定在凝胶结构中，使外界因素对酶的影响减弱。但是固定化酶和游离酶在酸性条件下的稳定性较差，因此在溶液状态下保存SAM合成酶需要选择碱性缓冲液系统。

图6 pH对固定化和游离SAM合成酶稳定性的影响Fig.6 Effects of pH on the immobilized and free SAM synthetase

2.2.3 固定化酶的操作稳定性 将1 g固定化酶与10 mL反应液在35℃下连续反应5批次，每次反应时间为8 h，每次反应后分别测定残余酶活力，以第1批次反应交联固定化酶的总活力为100%，计算相对酶活力，结果如图7所示。在第1批次反应后固定化酶活力有一定程度的下降，残余酶活为91%，连续反应5批次后酶活力仍然保持64%，固定化酶活性的降低可能是载体表面部分酶分子的脱落以及部分固定化酶变性失活所致。同时经过5批次反应后，固定化酶的形态没有明显变化。在底物三磷酸腺苷（ATP）浓度为30 mmol/L的条件下，固定化酶催化底物ATP的转化率仍超过95%，说明固定化SAM合成酶具有较好的操作稳定性以及催化活性。

图7 固定化酶的重复使用性Fig.7 Repeated usability of the immobilized enzyme

2.2.4 固定化酶的贮存稳定性 分别将抽滤的固定化酶和游离酶（pH 7.5）置于4℃冰箱中，贮存15 d后测残余酶活，游离酶活性仅残余17%，而固定化酶保存了78%的酶活性，说明固定化酶有较好的贮存稳定性。用于固定化的SAM合成酶是经过一步纯化的粗酶，所以游离酶溶液中含有各种蛋白酶，在溶液长期贮存过程中容易降解，而通过戊二醛交联的固定化酶蛋白空间构象受到限制，所以稳定性较高。

3 结语

壳聚糖是最常用的天然高分子固定化酶载体，通过戊二醛交联将酶固定在壳聚糖微球上，大大提高了SAM合成酶的稳定性。研究结果表明，最佳固定化条件为：壳聚糖质量浓度为2.5 g/dL、戊二醛体积分数为0.8%、固定化酶量为6 mg/mL、固定化时间为12 h。固定化酶热稳定性得到大幅度提高，同时固定化酶具有较好的强度和操作稳定性，将固定化酶用于SAM的催化合成，连续反应5批次后，酶活性仍保留64%，固定化酶催化底物ATP的转化率超过95%。研究成果为固定化酶法生产SAM奠定了基础。

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