不同温度下嗅觉可视化技术区分猪肉中主要致腐菌

邹小波， 郭雅宁， 石吉勇， 黄晓玮， 黄 林， 李 昕

（江苏大学 食品科学与生物工程学院，江苏 镇江 212000）

目前猪肉中致腐菌的检测方法有GC/MS[1-2]、微生物培养[1]等方法。这些方法可以准确地区分猪肉中的不同致腐菌，但是过程复杂、试验周期长、成本高，不能做到快速检测及时判断。目前大部分研究仅针对4℃冷藏贮藏条件下的猪肉致腐菌检测[3-6]。在我国很多地方，猪肉从屠宰到餐桌往往要经历冷冻、冷藏等多种贮藏方式，甚至在冷链不完善的地区还要在常温下贮藏，因此有必要针对室温（20℃），冷藏（4℃）和冷冻（-16℃）3种贮藏温度条件下，对猪肉中主要致腐菌的快速、无损检测技术进行研究。

嗅觉可视化技术是一种气体成像技术[7-9]，该技术根据可视化传感器与待测气体反应前后的颜色变化对气体进行定性定量判别[10-12]。可视化传感器不仅利用气体敏感材料和待测气体之间的范德华力等很弱的相互作用，而且引入了金属键和极性键等较强的化学反应，所以在检测精度和灵敏度方面具有很强的优势[13-15]。

猪肉贮藏过程中主要致腐菌对猪肉腐败起主导作用，其利用猪肉中的蛋白质、碳水化合物、脂肪等营养物质进行自身代谢，产生的代谢产物如硫化物、胺类等可导致猪肉的气味和pH值发生变化，同时这些气体的种类和浓度与微生物种群及其数量也有密切的关系。作者精心挑选4种卟啉化合物组成可视化传感器，分别在室温（20℃）、冷藏（4℃）和冷冻（-16℃）3种贮藏条件下，通过嗅觉可视化传感器与挥发性气体反应前后的颜色变化，尝试对猪肉中的3种主要致腐菌进行区分。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与菌种 猪肉购于江苏省镇江市屠宰场，为生鲜背最长肌。按照文献[1]所述方法取其内部无污染肉块约1 080 g，修去筋腱。

猪肉贮藏过程中的主要致腐菌为韩国假单胞杆菌、热杀索丝菌及梭状芽胞杆菌，它们均为实验室分离纯化、鉴定后保存的菌种[1，16-20]。

1.1.2 试剂 无菌生理盐水，体积分数75%酒精，卟啉试剂（Sigma，美国）。

1.1.3 仪器与设备 压力蒸汽灭菌锅（YM50型，上海，三申医疗器械）；双人单面净化工作台（SW-CJ-2FD 型，苏州）；冰箱（美的，合肥）；生物显微镜（XS-212-202 型，南京，JNOEC）；生化培养箱（LRH-150型，上海，一恒科技）；扫描仪（Scanjet G4050型，美国，HP）。

1.2 样本制备

1.2.1 肉块的制备 于无菌操作台将猪肉分割成108块，精确称取10 g左右的均匀小块，进行表面灭菌后装入无菌薄膜袋中备用。

1.2.2 接种与贮藏 参照文献[1]的方法，韩国假单孢菌、热杀索丝菌和梭状芽孢杆菌经过培养，获得菌原液。取上述分割好的无菌肉块12块作为对照组，再取36块分为3组，每组12块，分别浸泡于3种菌原液中，15 s后取出，沥干菌液，装入无菌薄膜袋中[14]。将接种后的猪肉按类分别放在20、4℃和-16 ℃条件下贮存，20 ℃条件下分别于 0、8、16、24 h后取样分析，4℃条件下分别于 0、2、4、6 d后取样分析，-16℃条件下分别于0、3、6、9 d后取样分析。

1.2.3 腐败菌计数 参照文献[21]的方法，在无菌操作条件下，将样品剪碎放入含有10 mL灭菌生理盐水的灭菌乳钵内，经充分研磨做成均匀稀释液。用无菌微量移液器吸取0.1 mL样品匀液，沿管壁缓慢注入盛有10 mL稀释液的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成体积比1∶100的样品匀液。选择2个适宜稀释度的样品匀液，在显微镜下进行计数。

1.3 嗅觉可视化技术检测方法

1.3.1 传感器的制作 针对猪肉腐败过程中气味变化的特点，从200多种卟啉中优选出4种与猪肉挥发气体发生反应最灵敏的卟啉化合物组成可视化传感器阵列。为减少环境湿度对传感器精度的影响，选择具有良好疏水性的C2反相硅胶板作为传感器载体，其微小的孔径可以帮助吸附气体分子加快检测速度。利用毛细管点样法将气敏材料固定在传感器载体，形成一个如图1所示的2×2的可视化传感器阵列。

图1 传感器阵列Fig.1 Sensor array

1.3.2 跟踪检测 取已准备好的60块猪肉，将其放在特制的容器底部，将传感器阵列放置在容器顶部，然后将装置密封放于恒温避光处。可视化传感器阵列上色敏材料（卟啉）的颜色变化用扫描仪扫描获取[15-16]。针对不同温度下的样品，跟踪监测的间隔不一样，20℃下每隔8 h扫描一次，4℃下每隔2 d扫描一次，-16℃下每隔3 d扫描一次。

1.4 传感器响应信号提取和数据建模分析

可视化传感器与猪肉顶空可挥发性气体发生颜色反应，只有对传感器与猪肉气体发生反应前后的图像进行图像处理，使其数字化，才能对这些变化进行定量描述，进而用来检测样品。由扫描仪获得的传感器反应前后图像经过图像处理，通过如下公式提取可视化传感器阵列上色敏材料 （卟啉）反应前后颜色变化的绝对值ΔR、ΔG、ΔB。

式中，a（after）代表可视化传感器阵列与待检测气体反应后的图像，b（before）代表可视化传感器阵列与待检测气体反应前的图像。将ΔR、ΔG、ΔB值作为输入变量，应用Matlab7.0软件建立模型进行PCA分析[22]。

2 结果与分析

2.1 致腐菌变化规律

图2（a）（b）（c）分别为-16、4 和 20 ℃条件下猪肉中3种主要致腐菌（韩国假单胞杆菌、热杀索丝菌、梭状芽胞杆菌）的菌总数变化图。从图2中可以看出在这3种温度下猪肉的致腐菌总数的初始值均为103-104个/g。随猪肉存放时间的增加，3种腐败菌的总数均呈明显的上升趋势。

图2 -16，4，20℃下猪肉中菌数变化情况Fig.2 Bacteria count changes in pork at-16，4，20 ℃

如图2（a）所示，在-16℃条件下，致腐菌菌总数在第9天时达到107个/g。菌总数与初始值相比增加了一倍，韩国假单胞杆菌明显是优势菌。如图2（b）所示，在4℃条件下，由于温度升高，细菌生长速率相对加大，在第6天的时候就已经达到107个/g，此时也达到了初始菌数的两倍。如图2（c）所示，在20℃条件下，细菌生长速率明显加大，在16 h后就已达到107个/g，在24 h后达到108个/g并伴随着明显的腐臭味，在这3种温度条件下，猪肉中3种主要致腐菌的生长速率的增加程度都比较明显，且韩国假单胞杆菌是造成猪肉腐败的主要菌群，在-16℃条件下尤其明显，结果与文献[1]一致。

2.2 嗅觉可视化技术检测

表1为20、4℃和-16℃ 3种贮藏温度下，嗅觉可视化传感器跟踪检测染有3种致腐菌猪肉样本的特征图像。由特征图像可以看出，每幅图的反应变化都有所不同，随着猪肉贮藏时间的延长，传感器的响应范围在扩大，且反应强度也逐渐增强。从嗅觉可视化传感器阵列颜色变化（图3）中，能够看出染有3种致腐菌（韩国假单胞杆菌、热杀索丝菌、梭状芽胞杆菌）的猪肉样本有明显的差异，并且在不同温度下（不同贮藏时间）（20 ℃（8、16、24 h），4 ℃（2、4、6 d），-16 ℃（3、6、9 d））猪肉的变质情况不同。这是由于不同的菌产生的挥发性气体的质量分数有一定的差异，并且随着贮藏时间的延长，猪肉顶空挥发性气体成分的种类和浓度不断变化所致。

前期相关研究[15，21]表明，生鲜猪肉处于贮藏初期，新鲜度高，挥发性气体成分较少，多是烃类和酮类等气体，只能通过与少许金属卟啉发生非特异性吸附，反应强度较弱。随着贮藏时间的延长，生鲜猪肉品质开始下降，与腐败有关的含硫含氮气体分子开始产生。此时，金属卟啉容易与含硫和含氮气体分子发生特异性吸附，金属卟啉中的金属离子与这些化合物中的硫原子和氮原子发生键合得到电子对形成配位键，从而引起较强烈反应，传感器反应强度愈来愈明显。对照组猪肉样本由于其自身内部含有少量细菌导致其腐败变质，并且每种致腐菌在不同温度下生长速度不一样，产生的气味也有差别。染有韩国假单胞菌猪肉样本产生的挥发性气体中含硫化合物、酯和酸比较多；染有热杀索丝菌猪肉样本产生的挥发性气体中挥发性酸较多；染有梭状芽胞杆菌猪肉样本的挥发性气体中分子胺和氨类物质较多。这也就是可视化气体传感器可以区分不同菌种不同贮藏时间的主要原因。

图3 猪肉在20℃、4℃和-16℃下0～24 h、0～6 d和0～9 d的特征图像Fig.3 Feature images of pork storing below 20 ℃，4 ℃ and-16 ℃ during 0～24 h，0～6 d and 0～9 d

2.3 数据处理与分析

在-16、4℃和20℃这3种贮藏温度下，传感器阵列图像上每个卟啉化合物的ΔR、ΔG、ΔB值组成3个15×4×3的矩阵，将这些矩阵分别进行主成分分析。在20℃常温条件下的第一主成分的贡献率为59.82%，第二主成分的贡献率为21.34%；在4℃冷藏条件下的第一主成分的贡献率为64.48%，第二主成分的贡献率为22.32%；在-16℃冷冻条件下的第一主成分的贡献率为67.23%，第二主成分的贡献率为24.41%。样本经PCA分析后的数据前两个主成分的二维投影如图 4 所示，图 4（a）（b）（c）分别为3种贮藏温度条件下，传感器区分对照组、染有梭状芽孢杆菌样本、染有热死环丝菌样本、染有假单胞菌样本的情况。

从图3中可以明显看出，3种染菌组均能相互分开。

图4 主成分分析结果Fig.4 Principal component scatter plot

图3（a）为20℃条件下的主成分分析结果，染有韩国假单胞杆菌的14个样本均能被正确识别，1个样本被误判为染有热死环丝菌样本组；染有热杀索丝菌和梭状芽胞杆菌的猪肉样本组均能被正确识别，总体识别率达到98%。

3 结语

在-16、4、20℃这3种贮藏温度下，嗅觉可视化技术结合主成分分析方法对猪肉中的3种主要致腐菌进行了检测，结果显示韩国假单胞杆菌样本组的识别率为98%，梭状芽孢杆菌和热杀索丝菌样本组的识别率均为100%。表明，应用嗅觉可视化技术可以区分猪肉中的上述3种主要致腐菌。

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