细胞穿膜肽TAT与小鼠干细胞转录因子Oct4融合表达及纯化

王 军， 雷楗勇， 陈 蕴， 金 坚

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

Oct4是维持胚胎干细胞自我更新和多潜能性 的重要的转录因子之一，被广泛应用于细胞重编程，形成了具有类似胚胎干细胞性质的诱导多功能干细胞 IPS（induced pluripotent stem cells）[1-3]。目前，由不同量组合的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等转录因子形成的细胞重编程技术，主要采用病毒包装转染的方式将转录因子整合入细胞中[4-5]。由于病毒载体转染效率和整合位点的差异，导致转录因子无法准确定量干预。作者利用细胞穿膜肽TAT可高效介导蛋白进入细胞的特征[6-7]，设计和生物制备TATOct4融合蛋白，并评价其穿透细胞的能力。加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，30℃诱导表达8 h。8 000 r/min冷冻离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清与沉淀，进行SDS-PAGE分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及细胞 TAT-Oct4基因、pET28a表达载体、BL21（DE3）原核表达菌株、NIH 3T3细胞，均由作者所在实验室保存。

1.1.2 主要试剂 Pfu DNA聚、Nco I、Xho I限制性内切酶，T4连接酶，均购自Fermentas公司；胶回收试剂盒、IPTG、卡那霉素，购于上海生工生物工程股份有限公司；Anti-6*His一抗，购自Abcam公司；Alexa Fluor 488荧光标记的二抗，购于碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 TAT-Oct4目的基因的克隆 设计含Nco I和Xho I上下游引物，引物序列如下：

上游引物：5'-CATGCCATGGCAATGCATCATC ATCATCATCATTCTTC-3'

下游引物：5'-CCGCTCGAGCGGTCAGTTTGAA TGCATGGGAGAGC-3'

以TAT-Oct4基因为模板，经PCR扩增目的基因，反应条件如下：95℃预变性 5 min；95℃变性45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 2 min， 循环 30次；72℃延伸 10 min；最后4℃保存。

1.2.2 pET28a-TAT-Oct4表达载体的构建 将PCR扩增获得TAT-Oct4基因与pET28a空载体分别用Nco I与Xho I双酶切，经胶回收后，在T4连接酶作用下连接转化入DH5α菌株，挑取单菌落，经双酶切验证后，送至上海“生工”进一步测序验证。pET28a-TAT-Oct4重组表达载体如图1所示。1.2.3 融合蛋白TAT-Oct4的表达鉴定 将测序正确重组表达质粒转入表达菌株BL21（DE3）获得重组表达菌株，挑取单菌落接种到含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当OD值达到0.6，

图1 重组表达载体pET28a-TAT-Oct4图谱Fig. 1 Schematic description of recombinant expression plasmid pET28a-TAT-Oct4

1.2.4 包涵体洗涤、纯化及复性 表达产物分别经洗涤液缓冲 I（50 mmol/L的 Tris-HCl，300 mmol/L的Nacl，质量分数1%的TritonX-100，2 mmol/L的尿素，pH 8.0）和洗涤缓冲液 II（50 mmol/L的 Tris-HCl，300 mmol/L 的 Nacl，2 mol/L 的尿素，pH 8.0）洗涤后，在变性缓冲液（50 mmol/L的Tris-HCl，8 mol/L的尿素，300 mmol/L的 NaCl，25 mmol/L的咪唑，pH 8.0）中溶解TAT-Oct4包涵体。在变性条件下，利用Ni-NTA sepharose纯化，纯化条件为：上样缓冲液 A（50 mmol/L 的 Tris HCl，8 mol/L 的尿素，300 mmol/L 的 NaCl，25 mmol/L 的咪唑，pH 8.0）和洗脱缓冲液B （50 mmol/L的Tris HCl，8 mol/L的尿素，300 mmol/L 的 NaCl，250 mmol/L 的咪唑，pH 8.0）分段洗脱收集各洗脱峰进行SDS-PAGE分析。将纯化获得TAT-Oct4重组蛋白经尿素梯度透析（4，2，1，0.5，0 mol/L 的 尿 素 ，50 mmol/L 的 Tris-HCl，100 mmol/L的NaCl，质量分数 10%的甘油，300 mmol/L的精氨酸，2 mmol/L的GSH/0.2 mmol/L的 GSSG，1 mmol/L 的 EDTA，0.2 mmol/L 的 PMSF，pH 8.0）复性，最后用PBS透析3次除去其它小分子，获得具有活性的TAT-Oct4目的蛋白质。

1.2.5 细胞免疫荧光 NIH 3T3细胞培养于含质量分数10%的FBS的DMEM培养液，待细胞贴壁24 h后，加入TAT-Oct4目的蛋白共培养6h。细胞经预冷的细胞固定液（体积分数95%的乙醇和质量分数5%的乙酸）固定10 min后，用含质量分数0.2%的TritonX-100的PBS室温下穿透细胞膜15 min。经PBS漂洗及封闭处理后，加入Anti-6*His一抗（稀释比例1∶250），4℃过夜孵育。PBS洗涤后，加入相应的Alexa Fluor 488荧光标记的二抗（稀释比例1∶500）室温处理1 h。细胞核经DAPI复染定位后，在Nikon TE 2000型荧光显微镜下观察拍照。

2 结果与讨论

2.1 目的基因TAT-Oct4扩增及构建

PCR扩增TAT-Oct4目的基因经质量分数1.5%DNA琼脂糖凝胶电泳分析，可见其相对分子质量大小与理论值1 158 bp接近，如图2所示。获得的重组表达质粒pET28a-TAT-Oct4经Nco I和Xho I双酶切，可形成约有5 300 bp的载体片段和1 158 bp的TAT-Oct4目的基因片段（见图3），结果与理论值相符。重组质粒送至上海“生工”测序，其测序结果与理论序列完全一致。

图2 TAT-Oct4基因的扩增结果Fig.2 Result of TAT-Oct4 amplification

图3 重组质粒pET28a-TAT-Oct4双酶切验证Fig.3 Double digestion result of recombinant plasmid pET28a-TAT-Oct4

2.2 融合蛋白TAT-Oct4表达产物鉴定

含有pET28a-TAT-Oct4宿主菌经IPTG诱导表达后，经质量分数15%SDS-PAGE分析，在相对分子质量约45 kDa处有特异性蛋白条带，与理论值相符（见图4）。超声破碎后，分离收集上清与沉淀分别进行SDS-PAGE分析，可以看到沉淀中含有大量目的蛋白质（见图5），由此可见目的蛋白质主要以包涵体形式表达。

图4 融合蛋白TAT-Oct4表达SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of TAT-Oct4 fusion protein expression in E.coli

图5 TAT-Oct4破碎上清与沉淀SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of TAT-Oct4 supernatant and pellets after lysis

2.3 TAT-Oct4纯化及复性收率

在分子设计时，上游引物引入His标签，方便目的蛋白质使用镍离子亲和柱进行分离纯化。TATOct4重组蛋白质在变性条件下，经镍柱分段洗脱后，洗脱收集峰进行质量分数15%SDS-PAGE分析，如图6所示，在100 mmol/L咪唑洗脱条件下（泳道6与7），可获得纯度90%以上的目的蛋白质。同时也可观察到，整个纯化过程中杂蛋白相对较少，说明包涵体经洗涤后，其纯度已经相对较高。研究表明，在包涵体复性过程中，降低蛋白质初始浓度和化学添加剂如甘油，可有效减少蛋白质分子之间的聚集，从而提高复性收率[8]。同时对于含有二硫键的蛋白质，引入氧化还原体系GSH/GSSG能促进蛋白质在复性过程中正确折叠[9]。作者采用尿素梯度透析复性，同时加入促进复性的化学添加物，最终TAT-Oct4平均收率8.8%，同时可观察到复性蛋白初始浓度越高，其收率越低，见表1。

图6 TAT-Oct4纯化产物SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of TAT-Oct4 after purification

表1 TAT-Oct4复性收率Table 1 Refolding filed of TAT-Oct4 using urea gradient dialysis

2.4 TAT介导Oct4穿透细胞能力

细胞穿膜肽（cell penetrating peptides）是一类富含精氨酸或赖氨酸[10]，并且能将大分子物质携带到细胞胞浆甚至细胞核内部的一类短肽[11]。常用的有TAT（YGRKKRRQRRR）和人工合成的多聚精氨酸或赖氨酸。作者在Oct4的N端引入细胞穿膜肽TAT介导其快速进入细胞。NIH 3T3与重组蛋白TAT-Oct4（终质量浓度 6 μg/mL）共培养 6 h 后，在荧光显微镜下观察，近100%的细胞含有TAT-Oct4融合蛋白，并集中分布于细胞核内（如图7（b））。对照组（图 7（a））加入相应的荧光标记二抗。

图7 TAT-Oct4穿透细胞免疫荧光分析Fig.7 ImmunocytochemistryanalysisofTAT-Oct4 penetrating cells

3 结语

诱导多功能干细胞的产生，避开了干细胞伦理和免疫排斥两大难题[12]，然而利用病毒技术获得的诱导多功能干细胞具有致瘤的风险，因此限制其临床应用[13-14]。作者成功构建并制备了TAT-Oct4融合蛋白，镍柱纯化后，其纯度高达90%。通过尿素梯度透析复性的方法，TAT-Oct4的平均收率为8.8%。同时验证了细胞穿膜肽TAT能高效地将Oct4转导进细胞内，为建立蛋白质诱导IPS奠定了基础。然而TAT-Oct4在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在，其可溶性表达有待进一步摸索与改造。

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