微生物法检测乳粉中抗生素残留的构建

王超逸，马 凯，王勇军

(浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300)

抗生素作为有效防病治病药物在禽畜及水产养殖业中已被广泛应用，但抗生素的滥用不可避免地造成禽肉和水产品中抗生素残留超标。当前，抗生素是动物性食品安全中最常见和最重要的污染源。人长期摄入含抗生素的食品后，不断在人体内积累，最后导致人体产生过敏反应、细菌产生耐药性、菌群失调，更加严重的危害如氯霉素能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症及新生儿、早产儿灰色综合症等［1］，严重危害身体健康。因此，寻求简便、快速、准确、敏感性高的检测方法，加强动物源性食品抗生素残留快速检测及监控是当前食品安全的一项重要内容。

抗生素残留检测方法主要有微生物检测法、色谱法和免疫分析法等方法［2-4］，当前应用的标准方法为免疫分析法灵敏度高，但是检测成本要求较高，只能检测单一抗生素，不易于推广。本研究利用微生物生长抑制原理以及微生物生长后酸碱度变化的规律，建立了一种简易高效抗生素检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌种与乳粉样品

供试菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus sterothermophilus)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心 (10208)。脱脂乳粉和全脂无抗乳粉由国家乳品检测中心提供。

1.1.2 试剂

青霉素G、土霉素、链霉素和头孢拉定标准品均购自AMRESCO 公司，溴百里酚纳、溴甲酚紫及其他试剂均为分析纯。标准贮备液:精密称取青霉素G、土霉素、链霉素标准品各0.25 g，分别用超纯水溶解并定容至25 mL，浓度均为10 mg·mL-1。

1.1.3 培养基

固体培养基:蛋白胨10 g;酵母粉5 g;氯化钠10 g;琼脂15 g 溶于蒸馏水中，用NaOH 溶液调pH 值7.0，最后定容至1 000 mL，分装于锥形瓶中，121℃下高压灭菌20 min。

液体产孢培养基:牛肉膏5 g;蛋白胨3 g;氯化钠5 g;蒸馏水1 000 mL，用NaOH 溶液调pH 值为7.0，分装于锥形瓶中，121℃下高压灭菌20 min。培养前，加入0.5 g 的MgSO4，制成产孢培养基。

检测培养基:蛋白胨5 g;葡萄糖10 g;酵母粉2 g;指示剂0.03 g;蒸馏水定容至1 000 mL，pH 值调至7.5，分装于锥形瓶中，121℃高压灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 嗜热脂肪芽孢杆菌的培养

利用平板划线法，将菌种在LB 培养基上60℃纯化培养，将得到的单菌落接种到装有液体产孢培养液的试管中60℃摇床培养，每隔8 h 取细菌悬浮液进行梯度稀释活菌计数，同时孔雀绿染色并镜检观察芽胞形成，血球计数板上计算芽孢的数量。

1.2.2 嗜热脂肪芽孢杆菌悬浮液的制备

将培养获得芽孢用无菌蒸馏水冲洗3 次，8 000 r·min-1离心;用无菌水进行稀释，梯度稀释平板培养进行芽孢浓度测定;最后用无菌水重悬，获得0.5×107mL-1的芽孢悬浮液，备用。

1.2.3 嗜热脂肪芽孢杆菌对不同抗生素的敏感性

分别将青霉素G、土霉素、链霉素和头孢拉定等4种抗生素终浓度调至0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600，3.200，6.400，12.800，25.600 μg·mL-1，加入滤纸片，浸泡30 min;将芽孢悬浮液100 μL 均匀涂布于固体培养基上，将浸泡好的滤纸片放置于培养皿的中央，60℃培养36 h，测量抑菌圈的直径，试验重复3 次。

1.2.4 检测限的确定

用不含抗生素的全脂无抗乳粉稀释液将5种抗生素的标准贮备液分别稀释至0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.12 mg·kg-1(抗生素/乳粉)等10个标准溶液，按上述方法进行检测，重复3 次，确定3种检测菌种对4种抗生素的检测限。

1.2.5 指示剂的筛选

取96 孔板，加入300 μL 的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢悬浮液和200 μL 不同抗生素的全脂无抗乳粉稀释液，加入10 μL pH 指示剂溴百里酚蓝或溴甲酚紫，60℃下温育4 h，观察颜色变化。

2 结果与分析

2.1 菌种培养及芽孢的制取

嗜热脂肪芽孢杆菌是一种热耐受性细菌，60℃下菌体可快速生长［5-6］，隔夜培养，便可在培养基表面形成肉眼可见的菌落。跟踪细菌生长过程，嗜热脂肪芽孢杆菌在24 h 时进入指数生长阶段，在56 h 时进入稳定期 (图1)。比较发现，MgSO4对细菌生长没有明显的影响，但能明显诱导芽孢形成，使芽孢形成期提前6～7 h;在80 h 时，芽孢的比例达到97% 以上。根据嗜热脂肪芽孢杆菌的生长曲线和芽孢形成特点，初步确定了嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢制备条件为:利用添加MgSO4的液体产孢培养基，进行200 r·min-1震荡培养，80 h收集芽孢。

2.2 芽孢对抗生素敏感浓度及在乳粉中的检测限

图1 MgSO4对嗜热脂肪芽孢杆菌生长的影响

将收集获得的芽孢进行纸片法测定芽孢对青霉素G、土霉素、链霉素以及头孢拉定的敏感性。从表1 中可以看出，在平板上芽孢对青霉素G、土霉素、链霉素和头孢拉定的敏感度都在0.1 μg·mL-1以下，其中对头孢拉定的敏感程度最高。在此基础上，测定了嗜热脂肪芽孢杆菌检测乳粉的检测限进行了测定。由表2 可知，芽孢对这4种抗生素的检测限均可达0.08 mg·kg-1。说明嗜热脂肪芽孢杆菌，对这4种抗生素都具有较好的敏感性，达到了抗生素检测的要求。

表1 嗜热脂肪芽孢杆菌对不同抗生素的敏感浓度

表2 嗜热脂肪芽孢杆菌检测乳粉中抗生素检测限

2.3 pH 指示剂的筛选及微生物显色法测定

嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢萌发生长后，培养液的pH 值将降低，其范围5.2～6.8［5］。根据该pH 值范围，选择了溴甲酚紫 (变色范围5.2～6.8)和溴百里酚蓝 (变色范围6.0～7.6)进行筛选。利用96 孔板进行芽孢液、显色液和乳粉悬浮液进行2.5 h 的共培养。从表3 可知，溴甲酚紫在检测限以下颜色变化是紫红色变黄色，颜色区分度明显，而溴百里酚蓝的颜色从浅蓝色变黄色，颜色区分度不明显，不利于肉眼观察。

表3 pH 指示剂的筛选

3 小结和讨论

通过本实验研究，测定嗜热脂肪芽孢杆菌对青霉素G、土霉素、链霉素以及头孢拉定的敏感程度，确定了嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用于检测乳粉中抗生素的检测限，达到了国家检测的标准 (TTC法)，同时筛选得到了溴甲酚紫作为显色指示剂可以高效敏感检测抗生素的含量。采用96 孔板进行抗生素残留的微生物筛选检测，可以完成一个板上多个样品在5 h 内的快速检测，比传统的平板法或者HPLC 法省时省力。同时，本研究建立的微生物显色检测比抑菌圈更易于观测和判别，因此有较好的检出限。嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢具有很强的抗逆性，利于保留及检测试剂盒的开发。当前，商品化的微生物试剂盒和免疫试剂盒的价格都比较高，本研究中所建立的微生物显色检测方法，操作简单，价格低廉，具有很好的推广应用前景。

［1］顾觉奋.抗生素［M］.上海:上海科学技术出版社，2001.

［2］马兆瑞，祝战斌，卡尔·莱金特.乳和乳制品中残留抗生素的检测方法［J］.中国乳品工业，2003，31 (4):37-40.

［3］刘兴泉，冯震，姚蕾，等.采用高通量微生物法检测四种抗生素在鸡蛋中的残留［J］.现代食品科技，2011，27(4):465-460.

［4］Renata Z，Joana S.An evaluation of different microbial and rapid tests for determining inhibitors in milk ［J］.Food Control，2007，18:541-547.

［5］吴潇，刘波，姚粟，等.嗜热脂肪芽孢杆菌的特性及应用［J］.中国消毒学杂志，2011，28 (2):215-217.

［6］Yoo J A，Hardin M T，Chen X D.The influence of milk composition on the growth of Bacillus stearothermophilus ［J］.Journal of Food Engineering，2006，77:96-102.