apoE-/-小鼠颈总动脉斑块不规则趋化因子和分子标志物CD11c的表达

许增祥，卢林明，张允贵，张根葆

皖南医学院 1病理学教研室 2病理生理学教研室，安徽芜湖241002

动脉粥样硬化 (atherosclerosis，AS)是一种与脂质代谢紊乱相关的免疫炎症性疾病。在粥样斑块中巨噬细胞和T细胞是主要成分。有研究显示树突状细胞 (dendritic cells，DCs)也存在于AS斑块内，在AS发病过程中由不成熟状态逐步发生成熟，影响AS的起始和进展［1］。未成熟DCs不表达CD11c，但可低水平表达一些黏附分子，成熟后可表达CD11c和一些协同刺激信号，如MHCⅡ、CD83、CD86等。DCs作为免疫反应的枢纽，是体内激活初始T细胞的主要抗原提呈细胞。它主要来源于血液中的单核细胞。单核细胞是AS斑块中泡沫细胞的前体细胞，在向炎症部位迁移的过程中需要趋化因子和黏附分子的参与。趋化因子Fractalkine(FKN)是目前发现的CX3C家族中的唯一成员，研究提示FKN在AS的炎症机制中可能发挥作用。本研究以高脂饲养的apoE-/-小鼠为动物模型，观察在AS斑块中FKN表达和DCs侵润的情况，并探讨FKN在趋化DCs进入血管内膜参与AS的可能机制。

材料和方法

材料 6～8周龄雄性apoE-/-小鼠24只，购自北京大学医学部 (许可证号:SCXK京2002-0001);按照完全随机法平均分为实验组和对照组，实验组饲以高脂饲料 (含5%的猪油、1%胆固醇);对照组饲以普通饲料。每只小鼠每天给予5 g饲料，自由饮水，水为pH值2.8～3.0消毒水。即用型免疫组织化学试剂盒 (SP法)、多克隆兔抗小鼠FKN抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;多克隆兔抗小鼠CD11c抗体购自深圳达科为生物技术有限公司。

血清脂质测定 饲养12周后，麻醉后摘眼球取血，离心，收集血清，采用酶法并用全自动生化分析仪测定血清中三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的浓度。

苏丹Ⅳ大体染色 每组各取3只小鼠，选取左侧颈总动脉开始段约1cm;磷酸盐缓冲液中仔细分离血管周围的结缔组织，用细铁丝穿过血管段，小心剪开血管。苏丹Ⅳ染色步骤:70%酒精2 min，苏丹Ⅳ染液40 min，80%酒精20 min，自来水冲洗1 h。将血管内皮向上平铺在载波片上，拍照。

HE染色 选取apoE-/-小鼠左侧相同部位颈总动脉约1 cm长血管条，石蜡包埋后，连续切片，蜡片厚度为5 μm，待有斑块后连续切片约100张，每隔10张选取1张，行HE染色。在高倍镜图像下，应用Image J软件测量血管原管腔面积和现管腔面积，血管狭窄率评价:血管狭窄率=(原管腔面积-现管腔面积)/原管腔面积，每条血管观察10个动脉断面，取其平均值。

免疫组织化学染色 SP法检测斑块处FKN及CD11c(DCs标记物)阳性细胞的表达，FKN抗体浓度1∶150，CD11c抗体浓度1∶100，按免疫组织化学试剂盒说明书操作，最后用二氨基联苯胺在显微镜下控制着色，苏木素衬染。阳性结果判定:细胞质或细胞膜出现清晰淡黄色至棕褐色颗粒着色为阳性信号。结合染色强度和阳性细胞数进行分级。2人双盲法观察切片，低倍镜下选取染色最强的部位，高倍镜下观察，每张切片随机选取10个高倍镜视野。按着色程度计分:细胞着色与背景相似者计为0分;着色浅、略高于背景者计为1分;中度色、明显高于背景者计为2分;强染、着色很深者计为3分。按阳性细胞比例计分:视野中阳性细胞数＜5%计0分，5% ～＜25%计1分，25% ～＜50%计2分，50% ～＜75%计3分，≥75%计4分。两项计分相乘后分为4级:0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性 (+)，5～8分为阳性 (++)，9～12分为强阳性 (+++)。若两个人观察结果相差3分则重新评定。计数CD11c+细胞数量时，以着色至少略高于背景者为准，随机数10个高倍镜视野，不足10个高倍镜视野的数整张切片;所得数据取平均值。

统计学处理 应用统计学软件SPSS 12.0进行统计分析，所有数据均用±s表示。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

血脂测定结果 高脂饲养apoE-/-小鼠12周后，摘眼球取血，采用酶法并用全自动生化分析仪测得血清中三酰甘油、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的浓度均高于普食组 (P＜0.05)(表1)。

AS病变程度分析结果

苏丹Ⅳ染色结果:apoE-/-小鼠颈总动脉经苏丹Ⅳ染色后显示为红色，结果显示，实验组动物斑块面积百分数 (12.42±1.25)%是对照组 (3.74±1.02)%的近4倍。实验组颈总动脉斑块面积明显增大 (图1A、1B)。

HE染色结果:每条血管观察10个动脉横断面，计算其血管狭窄率，并取平均值。实验组血管狭窄率为(38.58±3.82)%(n=8)，是对照组 (13.39±2.74)%(n=9)的近3倍。与对照组相比，实验组血管狭窄程度更加严重 (P＜0.05)(图1C/1D)。

表1 apoE-/-小鼠血脂测定结果 (n=12，±s，mmol/L)Table 1 The blood lipids of apoE-/-mice(n=12，±s，mmol/L)

表1 apoE-/-小鼠血脂测定结果 (n=12，±s，mmol/L)Table 1 The blood lipids of apoE-/-mice(n=12，±s，mmol/L)

与普食组比较，aP＜0.05aP＜0.05 compared with normal diet group

低密度脂蛋白胆固醇Low-density lipoprotein cholesterol普食组Normal diet group 0.48±0.24 10.14±0.74 0.47±组别Group三酰甘油Triglyceride总胆固醇Total cholesterol高密度脂蛋白胆固醇High-density lipoprotein cholesterol 0.07 7.08±0.76高脂饮食组High-fat diet group 0.86±0.17a 18.36±3.12a 0.56±0.17 17.41±3.17a

CD11c+细胞的分布 实验组CD11c+细胞数目18.46±5.17较对照组4.62±1.91明显升高 (P＜0.05)(图2A、2B)。CD11c+细胞在斑块肩部和内皮下有聚集倾向，而对照组阳性细胞数少，且散在分布。

FKN的表达 随机选取10个不同高倍镜视野，对细胞染色强度和阳性细胞数目进行打分，对二者的乘积进行比较，结果显示实验组不规则趋化因子的表达明显升高 (5.31±1.58比2.27±0.79)(P＜0.05)(图2C、2D)。

讨 论

DCs是体内最强的抗原提呈细胞之一，是免疫反应的枢纽。研究显示AS斑块内的DCs多聚集在受紊乱血流影响、易于发生AS病变的部位［2］;并且90%以上是与T细胞并存于有炎症浸润新生内膜处［3］。另有研究显示，DCs不仅参与AS的形成和发展，而且还可能与斑块的稳定性有关［4］。因此，有学者认为DCs可能成为未来AS防治的一个新靶点。但迄今为止，DCs在AS斑块形成、发展过程中的作用仍未明确。大部分DCs来自于血液中的单核细胞，单核细胞在血管内皮细胞 (endothelial cells，ECs)表面发生滚动、黏附、迁移，是由于激活的ECs表达的一系列选择素、黏附分子和内皮下产生的趋化物的作用。有研究表明斑块处存在的氧化性脂蛋白就是对DCs有较强趋化作用的物质［5-6］。

图1 apoE-/-小鼠颈总动脉斑块分布Fig 1 Atherosclerotic lesions in the common carotid artery of apoE-/-mice

图2 apoE-/-小鼠颈总动脉斑块CD11c+细胞分布和不规则趋化因子的表达 (免疫组织化学染色，×400)Fig 2 Expressions of CD11c+and fractalkine on atherosclerotic lesions of the common carotid artery from apoE-/-mice(Immunohistochemical staining， ×400)

不规则趋化因子FKN或CX3CL1是1997年新发现的一种化学趋化因子，它有两种存在形式，即膜型和可溶型。在人类功能紊乱的ECs上已发现有FKN的强表达［7-8］，此外，FKN还表达在平滑肌细胞 (smooth muscle cells，SMCs)［9］、DCs［10］和巨噬细胞［11］等。本研究在高脂饲养的apoE-/-小鼠颈总动脉AS斑块内可发现有FKN的高表达，可能是以上这些细胞表达的结果。FKN的唯一受体CX3CR1则可表达于T细胞和NK细胞［12-13］、血液中的单核细胞［14］。在冠心病患者与健康人的比较中，发现CX3CR1+细胞出现率更高［15］。FKN/CX3CR1的作用可能在AS发病机制中发挥重要作用。首先，ECs表达的FKN能诱导白细胞与之发生黏附，同时，病灶处的SMCs表达的可溶性FKN通过微循环环境促进T细胞和巨噬细胞迁移进入病灶处［16-17］。其次，细胞学研究显示内皮细胞 FKN的表达可促进DCs的成熟和CX3CR1的表达;利用RNA干扰技术抑制DCs CX3CR1表达后，进而可抑制DCs和ECs的相互作用，故 FKN/CX3CR1在 DCs和ECs相互作用中发挥一定作用［18］。另外，单核细胞和SMCs相互作用可以上调一些炎性细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子α、白介素1β、白介素6、CX3CR1和基质金属蛋白酶，并且依赖于FKN/CX3CR1间的相互作用［19］。再者，FKN还具有延长AS病变部位单核巨噬细胞和SMCs生存周期的作用［20］。本研究显示，在apoE-/-小鼠颈总动脉AS斑块内CD11c和FKN表达均升高，而CD11c是DCs的分子标志，这可能为FKN参与趋化DCs进入斑块处发挥作用提供了体外研究证据。

研究FKN/CX3CR1相互作用的目的在于探讨DCs进入内膜参与AS的可能机制，以便能更好地借助DCs的某些特性干预AS的发病过程，例如制作疫苗;或者从控制DCs进入病变部位的角度，应用CX3CR1的拮抗剂 (如药物AZ12201182)可抑制FKN的某些作用，如延长病变部位一些细胞的寿命和加速细胞有丝分裂;或阻断FKN引起的表皮调节素mRNA的表达［21］。所有这些可更好地研究FKN/CX3CR1这对趋化因子/受体的作用，或许可为AS的防治提供了一个较好的靶点。

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