一种高效的草莓总核酸提取方法

周历萍，肖雯霏，裘劼人，王淑珍

(浙江省杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

植物基因组研究的基础，通常要求所提取的DNA 分子应具有较高的纯度，且无断裂、降解现象，以保证下游工作的顺利进行。酚类化合物和多糖是影响植物DNA 提取的两个重要因素，其含量会随着植物组织的成熟而增加;由于草莓叶片中含有大量的多糖、蛋白质、多酚和色素等物质，这在很大程度上影响了高质量DNA 的提取。为此，本试验在原有CTAB 法基础上，对其提取方法进行了改良，旨在获得高质量草莓基因组DNA。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为杭州市农科院生物技术所保存的红颊和章姬组培苗，以及红颊和甜查理大田苗。

1.2 试剂的配置

DNA 提取缓冲液 (CTAB):0.1 mol·L-1(pH值8.0)的Tris-HC1，1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，2% CTAB，2% β-巯 基 乙 醇;3 mol·L-1NaAc。

1.3 DNA 的提取方法

称取草莓叶片0.5 g，放入研钵中，加入液氮研成粉末，移入1.5 mL 的离心管中，向离心管中加入600 μL 预热的CTAB 提取缓冲液，充分混匀;65℃水浴30～40 min，期间颠倒混匀2～3 次;水浴后加入等体积氯仿∶异戊醇 (24 ∶1)颠倒混匀，水平摇床上摇20～30 min，11 000 r·min-1离心10 min;转移上清液于干净的1.5 mL 离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，水平摇床上摇20～30 min，11 000 r·min-1离心10 min;转移上清液于干净的1.5 mL 离心管中，加入2 倍体积的无水乙醇，-20℃放置1 h;11 000 r·min-1离心10 min，弃上清，加入350 μL TE 溶解沉淀，然后再11 000 r·min-1离心10 min，将上清液300 μL 转入1.5 mL 的离心管中，加入1/10 体积的NaAc 和2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃放置1 h，11 000 r·min-1离心10 min，弃上清，以70%乙醇洗沉淀2 次，室温干燥。将干燥DNA 溶于50 μL TE 中，加入1 μL RaseAe，-20℃保存备用。

1.4 DNA 的检测

取DNA 样品，并加入溴酚蓝，以0.8% 的琼脂糖凝胶电泳，置于BIO-RAD Gel Doc 凝胶成像系统下观察拍照，检测DNA 的完整性。同时用Bio Spec-nano 浓度仪检测DNA 的浓度和D 值。

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

由图1 可以看出，所提取的DNA 电泳条带明亮整齐，基本无拖尾，表明所提取的DNA 纯度较高，且受损程度低，无明显降解。

2.2 Bio Spec-nano 检测结果

从图2 可知，CATA 法提取的DNA 的D260/D280为1.79～1.96，说明多糖、蛋白质等杂质去除较干净，DNA 纯度较高，达468～1 297 ng·μL-1，可满足下游工作的需要。

图1 提取不同草莓品种苗DNA 电泳结果

图2 不同草莓材料DNA BioSpec-nano 检测结果

由图3，4 可见，相同方法提取一个品种大田苗和组培苗的DNA 含量存在明显差异。组培苗的DNA 含量可达1 192.41 ng·μL-1，比大田苗DNA含量高60.1%。表明草莓DNA 的提取中宜选取幼嫩叶片，且以组培苗为佳;同时提取的DNA D260/D280均为1.96，说明提取方法能较好地去除多酚、多糖类物质，同时具有较好的稳定性。

图3 红颊大田总DNA BioSpec-nano 检测结果

图4 红颊组培苗DNA BioSpec-nano 检测结果

3 小结和讨论

材料的选择及处理。研究表明，利用同种方法对相同植物不同组织的DNA 提取效果往往差异很大，这是由于随植物个体发育差异，植物组织中酚类、多糖等代谢物质也随着组织器官的成熟而增加。所以选用幼嫩的叶片是植物提取DNA 的理想材料。草莓组织中富含多酚和多糖类物质，因此在草莓的提取中也宜选取幼嫩叶片，以组培苗为佳，尽可能减少多酚和多糖对DNA 提取的影响。

材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA 量少，纯度低。此外，β-巯基乙醇的用量也不宜过多，以免清除不净而影响后续的试验。

因CTAB 提取缓冲液低于15℃时易沉淀析出，所以应预先加热，使其在加入液氮冷冻研磨的材料时，提取缓冲液的浓度不变。

多酚、多糖等代谢物质的去除。常规提取法提取时材料易褐化，DNA 沉淀因含杂质呈现棕褐色，且有粘性物质附着，这种纯度不高的DNA 可能是由于材料在研磨过程中受氧化所致。本试验在叶片研磨后立即加入2% 巯基乙醇和CTAB 提取缓冲液，有效防止了叶片氧化的发生，使多糖和核酸有效地分离。同时，采取二次沉淀的方法，进一步去除褐化、粘性附着物，达到了纯化DNA 效果。

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