新疆维吾尔族不同性别人群中MK2基因变异与低密度脂蛋白胆固醇水平及肿瘤坏死因子-α的相关性

林 娜，李南方，姚晓光，王红梅，梁登攀，郭艳英，周 玲

新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心 新疆高血压研究所，乌鲁木齐830001

血脂异常是心血管病发病重要独立危险因素和基本病理基础，各种血脂成分异常与心脑血管疾病关系受到人们越来越多的关注，血浆胆固醇特别是低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)升高，是动脉粥样硬化发生和发展的必备条件，是最重要的致病性危险因素。研究显示，炎症反应在动脉粥样硬化发生发展中有着十分重要的作用［1-2］。丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一，能被多种炎性刺激所激活，并对炎症的发生、发展起重要调控作用。p38是控制炎症反应最主要的MAPK家族成员之一，MAPK激活的蛋白激酶2(mitogen-activated protein kinase activated protein kinase 2，MAPKAPK2或MK2)是p38 MAPK的重要下游激酶，MK2与脂代谢和炎性信号密切相关，能明显影响炎症因子表达，从而影响血脂调节［3］。流行病学资料显示，不同种族血脂水平有着很大差异［4］，不同性别间也有差异，在血脂异常人群中关于MK2的研究不多。维吾尔族约占新疆总人口的45%，该民族人口流动性小，是一个相对隔离的群体，维吾尔族血脂异常患病率高达34.8%［5］，在众多心血管病危险因素中处于重要地位，因此，本研究选择新疆和田地区维吾尔族人为研究对象，探索MK2基因44890c/t、rs 45514798单核苷酸多态性(single nueleotide polymorphism，SNP)与新疆和田地区维吾尔族人不同性别间LDC的相关性。

对象和方法

对象2007年1月至3月在新疆和田地区采用整群随机抽样调查方法，选取年龄30～70岁，3代内无通婚史的维吾尔族居民作为调查对象进行血脂异常的流行病学现况调查。共抽取了945名维吾尔族居民作为调查对象并完成调查，其中，男350人，女595人，本研究经新疆自治区人民医院、和田地区卫生局及政府相关医学伦理委员会同意，所有调查对象均签署知情同意书。

一般资料收集所有研究对象均进行问卷调查、体格检查和有关生化指标检测。按统一设计的调查表采用同一方式进行问卷调查。调查表内容包括:一般情况、吸烟、饮酒、饮食情况、生活方式、糖尿病病史等。体格测量包括身高、体重、腰围、臀围等，两次测量的身高、体重、腰围、臀围平均值被用于进一步数据分析。血脂异常诊断标准采用2007年《中国成人血脂异常防治指南》［6］推荐标准:总胆固醇: ＜5.18 mmol/L为正常，≥5.18 mmol/L为异常;LDLC:＜3.37 mmol/L为正常，≥3.37 mmol/L为异常;三酰甘油: ＜1.7 mmol/L为正常，≥1.7 mmol/L为异常;高密度脂蛋白胆固醇 (high density lipoprotein cholesterol，HDL-C): ＜1.04 mmol/L为异常，≥1.04 mmol/L为正常。

生化指标检测及DNA提取所有研究对象均留取清晨空腹静脉血样，迅速低温离心血浆并-20℃保存。血样所有生化指标 (包括血糖、血脂、肾功能、胰岛素等)由新疆维吾尔自治区人民医院检验科同批次专人检测完成，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)的测定采用北京北方生物技术研究所提供的TNF放射免疫试剂盒。基因组DNA提取按照基因组DNA提取试剂盒 (Paxgene blood DNA kit，AQIAGEN/BD Company，Franklin Lakes，NJ，USA)说明书进行，提取的DNA于-80℃保存备用。

MK2基因变异筛查及基因型鉴定在48例无亲缘关系的维吾尔族人中，采用美国ABI公司3100XL基因分析仪对MK2基因的所有外显子、外显子-内含子交界区、5'和3'非编码区至1 kb(untranslated regions，UTRs)序列进行PCR扩增及测序分析，测序结果通过Sequencher 4.7基因序列分析软件与MK2基因组标准序列进行比对，找出变异位点并明确其在基因序列中的位置及变异性质，利用专业遗传学分析软件SNPAlyze Ver.7.0.1 pro(日本)分析各个变异位点间的连锁不平衡关系，选择最小等位基因频率 (minor allele frequency，MAF)≥5%的常见变异位点和低频的错义突变。采用Taqman PCR技术，使用ABI 7900HT(Applied Biosystems，美国)对MK2基因的SNP位点进行基因分型。PCR的反应体系:总体积25 μl，其中人类TaqMan基因SNP分型预混液 (Applied Biosystems，美国)12.5 μl、SNP分型探针/引物预混液 (Applied Biosystems，美国)1.25 μl、DNA 模板 (20 mg/L)2 μl、去离子水9.25 μl。反应条件:95℃ 10 min预变性;92℃ 15 s变性，60℃ 1 min退火，72℃ 1 min延伸，43个循环;72℃ 7 min总延伸。基因分型的读取率为98.9%，重复检测的一致率为100%。

统计学处理采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，组间均数的比较用t检验，病例对照组的基因型频率分布采用χ2检验，不同基因型间血脂水平的差异采用方差分析，相关性分析采用线性回归，P＜0.05为差异有统计学意义。Hardy-Weinberg平衡检验、连锁不平衡 (linkage disequilibrium，LD)分析采用SNP Alyze7.0专业版 (DYNACOM Co.Ltd.，Mobara，Japan)软件完成。

结 果

MK2基因功能区测序分析及TaqMan分型结果对48例维吾尔族血脂异常患者MK2基因功能区测序，共发现7个变异位点，其中，内含子区5个［43364g/a、43896g/a(rs 45514798)、44517t/-(rs 35720082)、44890c/t、46044a/g］，外显子区2个 ［46469c/t(rs 4073250)、47225c/g(rs 3813961)］。根据变异位点的LD关系和MAF，共选取3个变异位点 ［43896g/a(rs 45514798)、44890c/t、46469c/t(rs 4073250)］进行基因型鉴定，其中46469c/t(rs 4073250)位点TaqMan-PCR分型失败 (仅分型出TT基因型，未分型出GG或GT基因型)(表1)。

不同性别间一般资料比较新疆和田地区维吾尔族男性年龄、腰围、总胆固醇、LDL、三酰甘油、吸烟、饮酒均明显高于女性人群，差异有统计学意义 (P＜0.05)，但是男女间TNF-α平均水平差异无统计学意义 (P=0.207)(表2)。

表1 48例血脂异常患者MK2基因功能区测序分析Table 1 Polymorphisms of the MK2 gene in 48 dyslipidemia subjects

不同性别间维吾尔族正常组和高LDL-C组基因型频率及等位基因频率分布比较经检测基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡，MK2基因 44890c/t、rs 45514798突变在不同性别的两组人群中基因型分布及等位基因频率44890c/t、rs 45514798基因型及等位基因分布在高LDL-C组和对照组中差异无统计学意义 (P＞0.05)(表3)。

表2 不同性别间一般资料比较Table 2 Comparison of general date between males and females

不同性别间MK2基因44890c/t、rs 45514798各种基因型与表型资料的比较男性中44890c/t位点不同基因型间年龄、总胆固醇、TNF-α差异有统计学意义 (P均＜0.05)，44890c/t中TT基因型携带者总胆固醇 (P=0.026)和 TNF-α水平 (P=0.006)均明显高于CC基因型携带者，CT基因型携带者总胆固醇水平也高于CC基因型携带者 (P=0.031)，LDL-C在3种基因型间有增高的趋势，但差异无统计学意义 (P＞0.05)。在显性模型中，CT+TT型与CC型相比，总胆固醇 (P=0.012)与 TNF-α(P=0.002)的差异均具有统计学意义。在女性中，显性模型分析提示，44890c/t基因型CT+TT型与CC型相比三酰甘油水平差异有统计学意义 (P=0.021)，其余血脂水平及TNF-α水平差异均无统计学意义(P均＞0.05)。rs 45514798在男性及女性中总胆固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油、体重指数 (body mass index，BMI)、TNF-α差异均无统计学意义 (P均＞0.05)(表4)。

MK2基因SNPs和LDL-C异常相关性分别以LDL-C和TNF-α水平作为因变量，采用线性回归分析与上述两指标相关的因素，在男性中，回归方程为:LDL-C=0.142+0.089 BMI+0.029 TNF-α，对方程内BMI及TNF-α单独检验，BMI和TNF-α对LDL-C水平有影响(P ＜0.05);TNF-α =6.247+1.347(44890c/t)，对方程内自变量单独检验，44890c/t对TNF-α水平有影响 (P＜0.05);在女性中，所得回归方程为:LDL-C=0.408+0.016 age+0.028 BMI+0.522腰臀比，对方程内自变量单独检验后，发现年龄、BMI、腰臀比对LDL-C水平有影响 (P＜0.05)。

讨 论

表3 MK2基因44890c/t、rs 45514798位点基因型及等位基因频率在不同性别维吾尔族正常对照组和高低密度脂蛋白胆固醇组的分布Table 3 Distribution of the genotype and allele frequencies of MK2 gene 44890c/t and rs 45514798 in the normal control group and high LDL-C group in males and females

由于HapMap数据库中无维吾尔族人的遗传信息，数据库中MK2基因的标签SNPs对维吾尔族人无特异性，故本研究策略是测序筛查维吾尔族人MK2基因功能区的变异位点，这样既可以发现民族特异性的常见变异，也能发现低频率的错义突变，然后选取代表性变异位点进一步在流行病学调查获取的维吾尔族自然人群中进行基因型分型及关联分析、临床特征分析。目前关于MK2与血脂的研究多在动物实验中进行，在少数民族与血脂紊乱人群中暂未见相关研究报道，本研究调查了MK2基因在新疆和田地区维吾尔族人群血脂异常发病中的作用。

表4 不同性别之间MK2基因两个位点44890c/t、rs 45514798各种基因型与表型资料的比较 (±s)Table 4 Comparison of genotypes and phenotypes between the MK2 gene foci 44890c/t and rs 45514798 between males and females(±s)

表4 不同性别之间MK2基因两个位点44890c/t、rs 45514798各种基因型与表型资料的比较 (±s)Table 4 Comparison of genotypes and phenotypes between the MK2 gene foci 44890c/t and rs 45514798 between males and females(±s)

a年龄中CT与CC比较差异有统计学意义 (P=0.017)，TT与CT比较差异有统计学意义 (P=0.006);b总胆固醇中CT与CC比较差异有统计学意义 (P=0.031)，TT与CC比较差异有统计学意义 (P=0.026);cTNF-α中CT与CC比较差异有统计学意义 (P=0.018)，TT与CC相比差异有统计学意义 (P=0.000)，TT与CT型比较差异有统计学意义 (P=0.047);d女性三酰甘油中CT与CC型相比差异有统计学意义 (P=0.037)Further LSD pairwise comparisons showed:aCT and CC(P=0.017)and TT and CT(P=0.006)was significant different in age;bCT and CC(P=0.031)and TT and CT(P=0.026)were significantly different in total cholesterol;cCT and CC(P=0.018)，TT and CC(P=0.000)，and TT and CT(P=0.047)were significantly different in TNF-α;dCT and CC was significant different in triglyceride in femal(P=0.037)

项目Item n 年龄(岁)Age(year)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TG(mmol/L)BMI(kg/m2)TNF-α(ng/L)男性Male 44890c/t CC 129 52.89±10.45 4.35±1.20 1.04±0.47 2.64±1.16 1.69±1.38 27.10±4.25 106.63±62.39 CT 163 49.97±10.24 4.69±1.34 1.07±0.35 2.81±1.28 1.70±2.42 27.61±4.50 128.44±86.15 TT 52 56.54±10.64a 4.83±1.44b 1.08±0.36 3.04±1.32 1.80±1.33 27.32±4.35 153.06±82.99c P 0.007 0.033 0.792 0.134 0.859 0.483 0.001 Dom 44890c/t CC 129 52.89±10.45 4.35±1.20 1.04±0.47 2.64±1.16 1.69±1.38 27.10±4.25 106.63±62.39 CT+TT 215 51.08±10.50 4.72±1.36 1.07±0.35 2.86±1.29 1.72±1.26 27.45±4.10 134.40±85.86 P 0.121 0.012 0.496 0.104 0.818 0.468 0.002 rs 45514798 GG 285 51.52±10.54 4.63±1.36 1.08±0.41 2.82±1.27 1.68±1.21 27.35±4.42 124.24±76.49 AG 57 52.33±10.73 4.35±1.09 0.99±0.34 2.58±1.16 1.86±1.72 26.88±3.86 125.56±90.88 AA 3 57.00± 6.93 4.68±0.94 1.07±0.23 2.32±0.20 1.88±0.96 30.67±6.03 55.14±26.19 P 0.593 0.339 0.302 0.340 0.634 0.307 0.316 Domrs 45514798GG 285 51.52±10.54 4.63±1.63 1.08±0.41 2.82±1.27 2.74±1.45 27.35±4.42 12 0.485 0.159 0.131 0.154 0.339 0.651 0.845女性4.24±76.49 AG+AA 60 52.57±10.58 4.36±1.08 0.99±0.33 2.70±0.49 2.70±0.49 27.07±4.01 122.04±90.01 P Female 44890c/t CC 234 49.18±10.77 4.40±1.32 1.08±0.35 2.42±1.11 1.64±1.15 27.19±4.16 133.45±79.06 CT 263 48.83±10.76 4.35±1.17 1.07±0.34 2.36±0.99 1.46±0.84d 26.80±4.58 130.39±86.90 TT 93 49.46±10.35 4.39±1.37 1.08±0.37 2.43±1.05 1.43±0.85 27.15±4.37 122.53±80.58 P 0.866 0.913 0.970 0.761 0.068 0.578 0.089 Dom 44890c/t CC 234 49.18±10.77 4.40±1.32 1.08±0.35 2.42±1.11 1.64±1.15 27.18±4.16 133.45±79.06 CT+TT 356 48.99±10.64 4.36±1.22 1.08±0.35 2.38±1.00 1.45±0.84 26.89±4.52 128.34±85.25 P 0.835 1.720 0.870 0.627 0.021 0.417 0.464 rs 45514798 GG 475 49.25±10.85 4.36±1.25 1.08±0.34 2.39±1.05 1.51±0.90 27.35±4.42 129.94±83.16 AG 104 48.09±10.05 4.44±1.32 1.08±0.38 2.43±1.05 1.56±1.26 26.88±3.86 131.64±82.84 AA 11 50.55± 9.63 4.64±1.20 1.06±0.37 2.22±1.21 2.05±1.07 30.67±6.03 136.48±74.06 P 0.544 0.663 0.984 0.790 0.174 0.359 0.953 Domrs 45514798GG 475115 49.25±10.85 4.36±1.25 1.08±0.34 2.39±1.05 1.51±0.90 26.92±4.3 0.406 0.448 0.910 0.822 0.333 0.317 0.802 9 129.94±83.16 AG+AA 48.32± 9.99 4.46±1.30 1.07±0.37 2.41±1.06 1.60±1.24 27.38±4.36 132.10±81.75 P

影响血脂代谢因素很多，其中包括遗传基因作用以及生活环境影响 (饮食条件和生活习惯)。主流观点认为血脂异常是一种低度炎症反应，同时许多资料显示炎症反应在动脉粥样硬化发生发展中有十分重要的作用，本研究所涉及MK2基因在炎症相关疾病中的关键作用已在体外和体内实验中得到证实［7-8］。已有报道血脂异常在不同性别之间存在差异［9］，在新疆维吾尔族人群中不同性别中也同样有差异［10］，本研究结果显示，男性中MK2基因44890c/t TT型与总胆固醇及TNF-α有关联 (CC＜CT＜TT)，但未发现44890c/t与LDL-C水平存在关联，仅存在增高趋势 (CC＜CT＜TT);女性中MK2基因44890c/t与三酰甘油有关联 (CC＞CT+TT)，说明MK2基因多态性分布在不同性别间存在差异，与既往研究报道一致。周玲等［4］通过对新疆少数民族血脂调查发现，新疆少数民族高总胆固醇现患率男性为23.01%、女性为14.05%，高三酰甘油现患率男性为13.06%、女性为4.0%。本研究结果显示，44890c/tTT型是男性高总胆固醇危险基因型，44890c/t位点TT基因型的男性LDL-C水平也较CC及CT基因型高，而44890c/tTT型则是女性高三酰甘油的保护基因型。进一步分析发现，44890c/t、rs 45514798多态基因型分布在高LDL-C和对照组中差异均无统计学意义。本研究发现在男性中，BMI、TNF-α可能对LDL-C水平有影响，是可能的危险因素，44890c/t位点可能对TNF-α水平有影响;在女性中，年龄、BMI、腰臀比对LDL-C可能有一定影响。但本研究中选择44890c/t的SNP及等位基因分布与LDL-C无统计学意义相关，可能需要扩大样本量来进一步验证，也可能MK2基因在功能上与炎症相关，血脂异常为轻度炎症反应，而本研究所选择TNF-α容易受多种因素影响，同时可能本研究选的人群和民族的异质性有关，这也需要在其他人群和民族中去进一步验证。

维吾尔族人约占新疆总人口的45%，该民族人口流动性小，是一个相对隔离的群体，血脂异常在维吾尔族人众多心血管病危险因素中处于重要地位，决定人群血脂水平差异的原因可能是膳食结构、经济状况和社会环境，维吾尔族主要膳食结构为羊肉和乳制品，因而属于血脂异常的高发群体。性别分析发现，肥胖均是导致男女高LDL-C的可能危险因素，男性中TNF-α是导致高LDL-C的危险因素，可能和男性中MK2的44890c/t中TT基因型对TNF-α水平有一定的影响有关，也可能与该民族男性嗜酒者多，伴有吸烟、喜食高热量食物较多有关［11］。

综上，本研究结果显示 MK2基因44890c/t、rs 45514798多态性与新疆维吾尔族人LDL-C水平不相关，可能存在的原因有种族的差异与位点选择的不同，因此，在今后的研究中应继续发现潜在的基因位点，MK2基因的2个位点及其他位点在其他民族血脂异常中的作用有待进一步研究。

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