延鱼止痛颗粒质量标准研究

★ 毕晓黎 程青云 李素梅

（1.广东省中医研究所 广州 510095；2.广州中医药大学 广州 510405）

延鱼止痛颗粒是广东省第二中医院医院制剂，由黄连，鱼腥草，延胡索，白花蛇舌草，茵陈，蒲公英，川楝子等药物组成，具有清胃祛湿、疏肝理气、和胃止痛的功效。在临床上常用于治疗慢性浅表性胃炎，属脾胃湿热兼肝郁气滞证型者，症见胃脘部疼痛或胀满，或牵连两胁，嗳气，反酸，烧心，纳呆，口干苦或口臭，尿黄，大便不爽等，具有较好的治疗效果。其中君药为黄连[1]，具有清热燥湿，泻火解毒的作用，以清胃火湿热见长。延胡索[1]为臣药，具有化瘀止痛的作用。为了更好地控制其内在质量，保证临床疗效。本文采用薄层色谱法对处方中延胡索、枳壳、鱼腥草进行了定性鉴别，采用高效液相色谱法对处方中盐酸小檗碱的含量进行了测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国）；DAD检测器；CAMAG AUTOMAIC TLC SAMPER 4全自动薄层点样仪（瑞士）；CAMAG Reprostar 3薄层成像系统（瑞士）；KQ5200 DE型数控超声波清洗器（昆山）；PBQ-II型薄层自动铺板器（重庆）；电热恒温干燥箱：DHG-9070A（上海）：METILER XS 205DU电子分析天平（瑞士）；电热恒温水浴槽（上海）。

1.2 试药

延胡索对照药材（批号：120928-201007）、枳壳对照药材（批号：120981-200403）、鱼腥草对照药材（批号：121046-200904）均购于中国药品生物制品检定所；延鱼止痛颗粒（批号：121101、121102、121103由广东省第二中医院制剂室提供）；

2 定性鉴别

2.1 延胡索[2]、枳壳TLC鉴别

取本品5g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，加浓氨试液调至碱性（pH9-10），加乙醚振摇提取3次，每次10mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材和枳壳对照药材各1g，同法分别制成延胡索对照药材溶液和枳壳对照药材溶液。按处方比例，取缺延胡索、枳壳的其他各味药，分别按制备工艺制成延胡索、枳壳阴性样品，再按以上处理方法制成延胡索、枳壳阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取供试品溶液5μL、延胡索对照药材溶液2μL、枳壳对照药材溶液5μL、枳壳阴性对照溶液5μL、延胡索阴性对照溶液5μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制成的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（8：2）为展开剂（展开前另槽加浓氨试液5mL预饱和5分钟），展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，供试液色谱中，在与枳壳对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照均无干扰。置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与延胡索对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照均无干扰，见图1。

图1 延胡索、枳壳TLC图

2.2 鱼腥草TLC鉴别

取本品5g，研细，加浓氨试液2mL润湿，加三氯甲烷25mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取鱼腥草对照药材粉末1g，加水80mL，煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至30-40mL，冷却，加氨水调节pH11-12，加三氯甲烷振摇提取2次，每次20mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为鱼腥草对照药材溶液。按处方比例，取鱼腥草的其他各味药，按制备工艺制成鱼腥草阴性样品，再按以上处理方法制成鱼腥草阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取供试品溶液10μL、鱼腥草对照药材溶液5μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制成的硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20：10：1：1）上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与鱼腥草对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，阴性对照无干扰，见图2。

图2 鱼腥草TLC图

3 盐酸小檗碱含量测定[2]

3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50：50）（每100mL中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0）；流速：1mL/min；柱温：25℃；检测波长345nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5 000。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含90.5μg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过二号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100：1）的混合溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性对照溶液制备

按处方比例，取缺黄连的其他各味药，按制备工艺制成阴性样品，再按“3.3”项下方法制成阴性对照溶液。

3.5 测定

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、黄连阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，见图3。结果显示在上述色谱条件下，盐酸小檗碱与其他峰较好的分离，阴性对照溶液在盐酸小檗碱峰相对应的位置上无其他色谱峰的干扰。

图3 HPLC色谱图

3.6 线性关系考察

精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液（90.5μg/mL）4、8、12、16、20μL进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积（Y）对盐酸小檗碱含量（X）进行回归，得标准曲线：

表明盐酸小檗碱在0.362-1.448μg范围内线性关系良好。

3.7 精密度试验

精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液（90.5μg/mL）10μL注入液相色谱仪，重复进样6次，测得其峰面积RSD值为0.31%，表明仪器精密度良好。

3.8 重现性试验

取供试品（批号：121101）5份，分别按照“3.3”项下方法制备供试品溶液，并按照上述色谱条件进行测定，结果盐酸小檗碱平均含量为0.030μg/g，RSD=0.66%，表明该方法重现性好。

3.9 稳定性试验

分别精密吸取同一份供试品溶液（批号：121101），分别于0、2、4、8、12h进样10μL，按“3.1”项下色谱条件进行测定，结果盐酸小檗碱峰面积RSD=0.31%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

3.1 0加样回收试验

精密称取9份已知含量的样品（批号：121101），分别精密加入一定量的盐酸小檗碱对照品，按“3.3”项下供试品制备方法处理，按“3.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。

表1 盐酸小檗碱加样回收率试验结果

3.1 1供试品测定结果

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测得三批样品中盐酸小檗碱的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

4 讨论

4.1 对方中延胡索进行薄层鉴别时，按照药典中延胡索的TLC鉴别方法，结果斑点清晰，但分离效果不够好，Rf值也较小，故将展开剂中甲苯所占的比例降低。结果斑点清晰，分离效果好，且阴性无干扰。

4.2 对方中枳壳进行薄层鉴别时，按照药典中枳壳的制备方法[2]制备，结果供试品色谱中与对照药材色谱没有相对应的斑点，且背景较深。参考了文献中多种方法[3-6]，结果均不理想，后发现采用文中延胡索的鉴别方法鉴别枳壳可行，结果斑点清晰，分离效果较好，且阴性无干扰。

4.3对方中鱼腥草进行薄层鉴别时，因该处方中鱼腥草是采用水煮的提取方法，制剂中无鱼腥草挥发油成分，故无法用药典方法对鱼腥草进行TLC鉴别。因此，在参考文献中多种鉴别方法[7-10]之后，本文采用上述方法进行鉴别，结果斑点清晰，分离效果好，且阴性无干扰。

4.4 盐酸小檗碱的含量测定方法，是按照《中国药典》2010年版黄连项下盐酸小檗碱的含量测定方法，通过方法学验证，该法准确、可靠，可作为延鱼止痛颗粒中盐酸小檗碱的含量测定方法。

4.5 本文所建立的方法操作简便、准确可靠、重现性好，可作为延鱼止痛颗粒的质量控制方法。

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