HPLC法测定不同产地山药饮片中尿囊素和腺苷的含量*

2013-11-07 08:22郑琴胡鹏翼龚莹莹伍振峰岳鹏飞杨明
江西中医药大学学报 2013年3期
关键词:腺苷饮片山药

★ 郑琴 胡鹏翼 龚莹莹 伍振峰 岳鹏飞 杨明*

(江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 南昌330004)

山药为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎。具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精的功能,主治脾虚食少、久泻不止、肺虚喘咳、肾虚遗精、带下、尿频、虚热、消渴等症[1],是中药常用药物之一。据现代医学研究,山药富含皂苷、粘液质、糖蛋白、甘露聚糖、植酸、尿囊素、山药素、胆碱、多巴胺、粗纤维、果胶、淀粉酶以及多种微量元素等[2]。2010年版《中国药典》一部中收载了性状、鉴别、检查和浸出物等项目,但缺少含量测定项,不足以对饮片质量进行全面有效的控制。本文建立了山药饮片中尿囊素、腺苷的高效液相色谱的含量测定方法,测定了不同产地山药饮片中尿囊素及腺苷的含量,从而为山药的质量研究提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪;ΜV2550紫外分光光度计(岛津);KQ-E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有公司);BSA223S sartoris分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司);BP211D电子天平(美国Sartorius公司)。

1.2 试药

尿囊素标准品(中国药品生物制品鉴定所,批号为11501-200202);腺苷标准品(中国药品生物制品鉴定所,批号为110879-200202);山药饮片收集于各产地,经江西中医学院龚千峰教授鉴定为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎切制而成。甲醇(色谱纯,国药集团化学试剂有限公司,批号T20110217);水为二次蒸馏水;其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 尿囊素[3]色谱柱:Pinnacle Amina C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(80:20),流速1 mL/min,柱温30℃,检测波长224 nm,进样量20 μL,理论板数按尿囊素峰计算应不低于3 000。对照品及样品HPLC见图1。

2.1.2 腺苷[4]Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以磷酸盐缓冲液(pH 6.5)[取0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液68.5 mL与0.01 mol/L磷酸氢二钠溶液31.5 mL混合]-甲醇(85:15)为流动相,流速1.0 mL/min;检测波长260 nm;柱温25℃;进样量20 μL;理论板数按腺苷峰计算应不低于3 000。对照品及样品HPLC见图1。

图1 尿囊素、腺苷对照品及山药样品HPLC

2.2 对照品贮备溶液的制备

精密称取尿囊素对照品9.20 mg置50 mL容量瓶中,加20%甲醇溶解稀释至刻度,摇匀,配成浓度为184 μg/mL;精密称取腺苷对照品2.02 mg置25 mL容量瓶中,加15%甲醇溶解稀释至刻度,摇匀,配成浓度为80.8 μg/mL。

2.3 供试品溶液的配制

2.3.1 尿囊素[5]精密称取山药饮片粉末(过3号筛)0.25 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入20%甲醇25 mL,密塞,摇匀,称定质量,超声处理0.5 h,放冷,再称定质量,用20%甲醇补足减失的质量,摇匀,0.45 μm微孔滤膜,取续滤液用于测定山药饮片中尿囊素的含量。

2.3.2 腺苷[6]精密称取山药饮片粉末(过3号筛)约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入15%甲醇10 mL,密塞,摇匀,称定质量,超声处理0.5 h,放冷,再称定质量,用15%甲醇补足减失的质量,摇匀,0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液用于测定山药饮片中腺苷的含量。

2.4 线性关系考察

精密吸取尿囊素对照品贮备溶液0.5、1、1.5、2、3、4 mL至5 mL容量瓶中,20%甲醇稀释至刻度,摇匀后分别精密吸取20 μL,注入液相色谱仪中,记录色谱图;精密吸取腺苷对照品贮备溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中,15%甲醇稀释至刻度,摇匀后分别精密吸取20μL,注入液相色谱仪中,记录色谱图;并以浓度(C)对峰面积(A)进行线性回归,得回归方程分别为A=5.5464C-0.5709(r=0.9994),A=69.628C-5.6118(r=0.9991),可见尿囊素在0.368-3.68 μg范围内与峰面积线性关系良好,腺苷在0.01616-0.1616 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液20 μL,按上述色谱条件连续进样6次,测定尿囊素、腺苷峰面积值,其RSD分别为1.12%、0.81%,表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液,室温放置,分别在0,1,2,4,8,12 h进样6次,测定尿囊素、腺苷峰面积值,其RSD分别为1.81%、0.98%,表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一供试品粉末(9号样品),按上述供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液,分别进行测定,测得尿囊素、腺苷平均含量分别为5.5901 mg/g、0.0636 mg/g,RSD分别为2.03%、1.83%(n=6),表明本试验方法重复性良好。

2.8 回收率

取重复性试验项下的山药样品粉末6份,精密称定,按高、中、低3种浓度分别加入尿囊素、腺苷对照品溶液,按2.3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,分别进行测定,计算回收率。结果尿囊素、腺苷平均加样回收率为99.93%、99.86%,RSD分别为0.87%、1.12%,见表1、2。

表1 尿囊素加样回收率

表2 腺苷的加样回收率(n=6)

2.9 样品含量测定

取不同产地山药样品粉末各3份,精密称定,按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液,测定峰面积,按外标一点法计算含量。不同产地山药药材中尿囊素、腺苷含量测定结果见表3。

表3 不同产地山药药材中尿囊素、腺苷质量分数(n=3)

1-9 号样品分别购自江西南昌不同的药店;10号样品购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司;其中,1-5号产地为河南,6、7号产地为安徽,8、9号样品产地为广西,10号产地为河南。

3 讨论

本文曾采用HPLC法梯度洗脱同时测定山药饮片中尿囊素、腺苷的含量[7,8],采用 phenomenex Luna C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为水(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0-5 mim,A为99%;5-15 min,A为99%-85%;15-23 min,A为85%);流速1.0 mL/min;检测波长为258 nm;柱温为30℃,进样量20μL。结果,在该条件下尿囊素及腺苷与其他峰均能较好的分离,但样品中尿囊素、腺苷的含量差异较大,在建立方法学时难以兼顾,因此本文将山药饮片采用不同方法处理,检测尿囊素、腺苷的含量。

尿囊素极性很大,在反相色谱柱上保留时间很短,试验过程中用普通ODS C18色谱柱,采用了多种液相条件,结果尿囊素的保留时间短,分离度不好,因此改用了氨基柱,流动相:甲醇-水(80:20),流速1 mL/min,柱温30℃,检测波长224nm,在该条件下山药中尿囊素峰形较好,与其他杂质峰分离较好。尿囊素热稳定性较差,本文采用超声提取以确保样品稳定。根据文献报道[9]对比40%甲醇、20%甲醇、40%乙醇、20%乙醇超声提取,结果以20%甲醇水溶液提取完全且峰形良好,并确定提取时间为30 min。

依次选用水、15%、50%,80%,95%乙醇为提取溶剂超声提取山药饮片中的腺苷,结果用15%乙醇提取效果最佳,高浓度的醇提取的腺苷峰型较差,故选定15%乙醇为提取溶剂。对超声、加热回流提取方法进行了考察,发现用二者差异不大,因此选择提取方法简便的超声法用于山药饮片中腺苷的处理方法。

2010年版《中国药典》一部中收载了性状、鉴别、检查和浸出物等项目,但缺少含量测定项,不足以对饮片质量进行全面有效的控制。目前对其化学成分的研究主要集中在多糖和尿囊素类成分,对其他成分的研究则相对较少,山药的质量控制模式还有待进一步优化[10]。腺苷为山药中的有效成分之一,可以作为山药以及山药相关产品的质量标准的指标性成分。本文建立的HPLC方法测定山药饮片中尿囊素和腺苷的含量,该法精密度高、操作简便、准确可靠,为山药饮片的全面质量控制提供了参考。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药出版社,2010:27.

[2]万瑾瑾,孙萍,刘旭海,等.山药组成成分的研究进展[J].亚太传统医药,2011,7(4):149-151.

[3]汤晟凌,兰海娟,邹慧龙.复方尿囊素乳膏中尿囊素的含量测定[J].中国药业,2008,17(1):22-23.

[4]李军,岳易恒,张丽萍,等.HPLC测定不同产地山药中腺苷含量[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(24):55-57.

[5]张芳芳,李伟东,杨光明,等.HPLC法测定麸炒山药饮片中尿囊素的含量[J].南京中医药大学学报,2010,26(2):146-148.

[6]陈华龙,李庆斌,谭小勇.HPLC法测定不同生长期粤北产山药中腺苷的含量[J].广东药学院学报,2011,27(4):392-394.

[7]李来玲.山药的质量评价研究[D].济南,山东中医药大学,2011.

[8]李慧娟.怀山药无硫加工工艺及饮片质量标准研究[D].郑州,河南中医学院,2008.

[9]张军,秦雪梅,薛黎明,等.HPLC-ELSD法测定山药中尿囊素含量的研究[J].药物分析杂志,2008,28(10):1 648-1 650.

[10]孙在芝,丛晓东,张云,等.山药化学成分和质量控制研究进展[J].亚太传统医药,2011,7(9):153-155.

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