HPLC法测定健脾颗粒中新橙皮苷的含量

★ 万欢 虞金宝 林森

（1.南昌大学理学院 南昌 330031；2.江西省中医药研究院 南昌 330046；3.江西省医药学校 南昌 330200）

健脾颗粒收载于中华人民共和国卫生部药品标准•中药成方制剂第2册，具有健脾开胃功效，用于脾胃虚弱所致脘腹胀满、食少便溏等证。处方由党参、白术（炒）、陈皮、枳实（炒）等组成，有文献报道[1，2]对该制剂中橙皮苷进行含量测定，由于橙皮苷为陈皮、枳实共有成分[3-5]，该方法专属性不强，且文献[3]报道新橙皮苷仅在少数地方产陈皮（如浙江）中含有，而江西、广西产陈皮中未检测到新橙皮苷，经试验证明，陈皮不干扰枳实中新橙皮苷的测定。中国药典2010年版枳壳药材标准显示，新橙皮苷含量高于柚皮苷，且分离度好，因此本实验采用HPLC测定制剂中新橙皮苷含量，并进行了方法学研究。

1 仪器与药品

HP-1100高效液相色谱仪（美国：包括1322A在线脱气机、G1311A四元梯度泵、G1315A二极管阵列检测器、HP化学工作站）；SimplicityTM个人型超纯水系统（Millipore公司），定量毛细管（美国Drummond公司），CQ-250超声波清洗仪（上海船舶电子设备研究所），新橙皮苷对照品（含量测定用，批号：111857-201102，中国药品生物制品检定所）；乙腈（色谱纯），其它试剂均为分析纯。健脾颗粒（批号：20120601、20120602、20120603、20120701、20120702、20120703（自制））。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的选择

色谱柱：Dikma Diamonsil C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-水（23：77），流速：1 mL/min，检测波长283 nm，柱温：30℃。在此条件下对照品、供试品在约14 min相同时间有一色谱峰，且阴性无干扰，见图1、2、3。

图1 新橙皮苷对照品色谱图

图2 供试品色谱图

图3 阴性对照色谱图

2.2 供试品溶液的制备

取健脾颗粒适量，研细，称取约1.4 g，精密称定，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声（功率250w，频率33kHz）处理30 min，放冷，再次称定重量，加甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，作为供试品溶液。

2.3 线性关系的考察

精密称取新橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含新橙皮苷0.42 mg的对照品溶液。取此对照品溶液适量，加甲醇分别稀释每1 mL含新橙皮苷浓度为10.10，25.25，42.08，75.74，126.24，210.40 μg的对照品溶液，分别吸取10 μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，将样品浓度与峰面积进行回归，得新橙皮苷回归方程为：Y=36521.35969X-27347.84，r=0.9999（n=6），在10.10-210.40 μg/mL范围内新橙皮苷浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精密吸取供试品溶液10 μL，按上述色谱条件，重复进样6次，测定供试品溶液中新橙皮苷峰面积值，计算供试品峰面积值的相对标准差为1.38%。

2.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10 μL，按上述色谱条件，分别在0、1、2、4、8、12 h进行测定，测得供试品中新橙皮苷峰面积的RSD为1.12%。表明本品中对新橙皮苷采用的提取方法稳定可行。

2.6 重复性试验

取同一批号样品共6份，照供试品溶液制备项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算含量，RSD为1.47%。

2.7 加样回收率试验

取本品适量，研细，取约0.70 g，共6份，精密称定，置具塞三角瓶中，各精密加入新橙皮苷对照品溶液（0.025 mg/mL）25 mL，按照含量测定项下实验，吸取10 μL注入液相色谱仪中进行含量测定，计算回收率，结果见表1。

表1 新橙皮苷回收率测定结果

2.8 样品测定

取本品，按供试品溶液的制备方法制备各供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，计算，即得。测定6批样品中新橙皮苷的含量，结果为每袋含新橙皮苷为13.37，13.51，12.26，13.27，14.05，14.46 mg。

3 讨论

3.1 枳实中含有挥发油、黄酮类、生物碱等成分，其中黄酮类成分为其主要成分之一，主要有橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、柚皮素、新橙皮苷、柚皮芸香苷等；黄酮苷对大鼠离体肠平滑肌的收缩呈抑制作用，且可对抗氯化钡、乙酰胆碱、组织胺引起的痉挛性收缩，但对大鼠血压和小鼠化学性疼痛及自发活动无明显影响。挥发油主要有镇静作用，中枢抑制作用[7]。枳实可使胃底平滑肌的张力明显升高，有促进胃运动、加速胃排空的作用等，该药理作用进一步证明了枳实具有破气除胀、消积导滞的作用[8]，因此，本次实验选取枳实中的新橙皮苷为检测指标。

3.2 有文献[1，2]以橙皮苷为指标对健脾颗粒进行含量测定研究，由于橙皮苷为陈皮、枳实共有成分[3-5]，该方法专属性不强，且橙皮苷难溶于水，微溶于甲醇[9]，实验中发现，水煎煮工艺中橙皮苷的转移率多在10%以下；而新橙皮苷则易溶于热水，溶于热乙醇，本实验中发现新橙皮苷的转移率约为40%，因此，以新橙皮苷作为该制剂的含量测定指标更为科学、合理。

3.3 实验中还分别对提取溶剂（甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇）、提取方法（超声和回流）、提取时间（20、30、45、60 min）和溶剂用量（15、25、50 mL）等条件进行考察，结果表明，新橙皮苷以25 mL甲醇超声提取30 min效果最好。

[1]金阳.健脾颗粒质量标准研究[J].中成药，2007，29（9）：1 403-1 405.

[2]林清，吴雪梅，马晓鹂，等.HPLC法测定健脾颗粒中橙皮苷的含量[J].中国药房，2009，20（9）：698-699.

[3]肖培根.新编中药志（第二卷）[M].北京：化学工业出版社，2002：346，454.

[4]王玉花，陈征，向大雄，等.对随机15批枳实药材中橙皮苷含量的考察[J].中国医院药学杂志，2006，26（7）：910-911.

[5]康四和，邓海英.不同生长期枳实枳壳中柚皮苷橙皮苷新橙皮苷的含量研究[J].时珍国医国药，2012，23（8）：1 918-1 919.

[6]谢贞建，焦士蓉，李恺，等.RP-HPLC法测定不同产地枳实中的柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷[J].西华大学学报（自然科学版），2009，28（2）：65-67.

[7]胡盛姗，王大元，邱萍，等.枳实有效成分的药理活性比较[J].中草药，1994，25（8）：419-421.

[8]张红，孙明江，王凌.枳实的化学成分及药理作用研究进展[J].中药材，2009，32（11）：1 787.

[9]柯铭清.中草药有效成分理化与药理特性[M].湖南：湖南科学技术出版社，1982：174.