舒尼替尼联合自体DC及CIK细胞治疗转移性肾癌的临床疗效观察

张亮，陈立军，王亚林，赵立

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一[1]，约30%的患者确诊时已出现远处转移。肾癌根治术后仍有20%～40%的患者出现复发或转移[2-3]。无远处转移患者的5年存活率为50%～95%，发生转移的患者则降至5%[4]。RCC对放化疗不敏感，免疫治疗与分子靶向治疗的出现为RCC的治疗提供了新的途径。本研究对解放军307医院泌尿外科2009年1月－2011年6月收治的应用舒尼替尼(sunitinib，商品名：索坦)联合自体树突细胞(dendritic cell，DC)及细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)进行治疗的27例转移性肾癌患者的资料进行分析，初步评价其疗效及安全性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 27例转移性肾癌患者中男23例，女4例，年龄34～79岁，平均55.2岁。均行肾癌根治术，左侧18例，右侧9例，术后病理示透明细胞癌23例、混合细胞癌2例、集合管癌1例、颗粒性细胞癌1例，病理分级为T1～3N0～1M0。术后肺部转移17例，肺转移合并骨转移3例，肾上腺转移2例，双侧腹股沟合并腹膜后转移1例，胸壁转移1例，对侧肾转移合并肺转移1例，肝转移合并颅内转移1例，肺部转移合并腹膜后转移1例，每例患者最少有1处可测量病灶(目标病灶)。27例患者均于术后2年内发生转移，发现转移后即入院治疗。所有患者或法定代理人知情并签署《知情同意书》接受治疗，并报医学伦理委员会批准。入选标准：①肾癌根治术后患者；②已有转移并至少有1处可测量病灶，即为目标病灶；③Karnofsky评分60～90分；④未接受过系统治疗；⑤首次靶向、免疫细胞治疗；⑥无明显过敏体质，无严重基础疾病；⑦愿意配合询问病史及体检并能够理解问卷内容。DC和CIK的分离及培养委托解放军307医院肿瘤生物治疗中心进行。

1.2 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分离 采集患者外周血，经Ficoll淋巴细胞分离液从单个核细胞分离淋巴细胞。采用生理盐水洗涤PBMCs 3次，采用无血清培养基悬浮于培养瓶，置37℃、5%CO2孵育箱。配制DC完全培养基150ml，含2‰白细胞介素-4(IL-4)、2‰粒-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，其中120ml用于当天DC培养，30ml用于第3天DC补液。

1.3 DC细胞的培养与回输治疗 取贴壁PBMCs，加入事先配好的DC完全培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。第3天添加含2‰IL-4、2‰GMCSF的培养液5ml。第6天细胞转染入肿瘤抗原并加入促成熟因子、沉默免疫负调控基因(inhibition of antigen presentation attenuators，iAPA)因子和4‰肿瘤坏死因子-α(TNF-α，1000U/ml)混合液。第7天收集成熟DC，离心后分装。1份用生理盐水洗涤后配制悬液1ml，加入2%人血白蛋白，当天回输，之后分别于第9、11、13天回输。DC质控标准如下。①细胞数：皮下四位点注射，每个注射点的量为1.5×106个细胞(0.2ml)；②细胞形态分类：回输细胞良好；③活细胞比例：≥95%；④回输前内毒素、细菌、真菌、支原体检测应为阴性。

1.4 CIK细胞的培养与回输治疗 取贴壁的PBMCs加入无血清培养基，使CIK培养的初始密度为(1～2)×106/ml；加入1‰ IFN-γ，装入细胞培养袋，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。第1天添加1‰ CD3单抗及1‰ IL-2，在培养过程中根据细胞生长状况适量添加含1‰ IL-2的培养液。第6、11天添加或换液，第10、12天取100μl CIK行革兰染色。第11、13天收集CIK细胞，洗涤后回输。CIK质控标准如下。①细胞数：两次回输细胞＞1×109个；②细胞形态分类：回输细胞良好，淋巴细胞＞90%；③活细胞比例：≥95%；④免疫荧光染色：CD3+≥85%，CD8+≥60%，显示活化良好；⑤回输前内毒素、细菌、真菌、支原体检测阴性。

1.5 治疗方案 索坦50mg，1次/d，口服。服药4周，停药2周(4/2给药方案)。药物治疗直至肿瘤进展或者出现Ⅲ或Ⅳ级不良反应需要减量或停药。减量方案：索坦37.5mg，1次/d，同样4/2给药方案，若仍无法纠正不良反应则停药。靶向治疗完成一个疗程后，以上述方案回输DC细胞和CIK细胞，间隔6个月后行下一个疗程的细胞免疫治疗。

1.6 指标观测及疗效评估

1.6.1 疗效评估 治疗前1周及细胞免疫治疗后2周行影像学检查评估疗效并在下一个疗程结束后进行确认，参照RECIST实体瘤疗效评价标准评估疗效。①完全缓解(CR)：所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周；②部分缓解(PR)：靶病灶最大径之和减少≥30%，至少维持4周；③疾病稳定(SD)：靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD；④疾病进展(PD)：靶病灶最大径之和增加≥20%，或出现新病灶。客观缓解率(ORR)=(CR+PR)/总例数×100%。疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/总例数×100%。

1.6.2 生活质量评估 以Karnofsky为标准比较治疗前1周与细胞免疫治疗后2周患者的生活质量[5]。提高大于10分为改善，下降大于10分为恶化，提高或下降少于10分者为稳定。总提高率=(改善+稳定)/总例数×100%。

1.6.3 免疫学评估 于治疗前1周及细胞免疫治疗后2周采集患者外周血，采用流式细胞法检测其中T淋巴细胞CD3、CD4、CD8和HLA-DR的阳性率，了解治疗前后机体免疫水平。

1.6.4 安全性评估 参考加拿大国家癌症研究所的常见毒性标准(NCIC-CTC)[6]，随访观察患者在治疗过程中的不良反应。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。无疾病进展生存时间(PFS)、总生存时间(OS)和95%置信区间(CI)估计采用Kaplan-Meier方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 疗效观察 根据RECIST行疗效评估，全部患者均治疗超过1个周期，1个周期后评价CR 0例，PR 4例，SD 17例，PD 6例。ORR为14.8%(4/27)，DCR为77.8%(21/27)。随访4～25个月，8例患者目前仍在接受联合治疗，其中1例患者服用索坦第15周时出现了血小板降低，最低为51×109/L，索坦减量后得以纠正；2例患者因索坦减量后仍无法耐受不良反应停药(分别为骨髓抑制和高血压)；1例患者因自身经济原因停药；14例患者疾病进展，无疾病进展生存时间(PFS)为4.0～19.5个月；10例患者死亡，总生存时间(OS)为6～21个月。全部27例患者中位PFS为16个月(95%CI 12.5～19.5)，中位OS未达到。

2.2 生活质量 以Karnofsky为标准比较治疗前1周与联合治疗后2周患者的生活质量，其中4例改善，16例稳定，7例恶化。KPS评分总提高率为74.1%(20/27)。

2.3 免疫评估 对27例转移性肾癌患者于治疗前及联合治疗第一个疗程后2周分析外周血T淋巴细胞亚群百分数，结果显示，经靶向及细胞免疫治疗后，CD4+、CD8+和CD3+T淋巴细胞百分数较治疗前升高(P＜0.05)，而HLA-DR+T淋巴细胞百分数与治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

2.4 安全性及不良反应 靶向治疗期间，1例患者在服用索坦的第15周出现血小板降低，最低为51×109/L，药物减量至37.5mg、1次/d维持治疗。2例患者因索坦减量后仍无法耐受不良反应(分别为骨髓抑制和高血压)停药，其他不良反应均在Ⅰ-Ⅱ级，其中最常见的为乏力、手足综合征、高血压、血小板减少、甲状腺功能减低和中性粒细胞减少等，经对症治疗后可缓解或耐受，不影响后续治疗。细胞治疗期间，5例患者细胞输注后出现一过性发热反应(37.4～38.2℃)，数小时后均可自行缓解。1例患者出现短暂头晕，休息后缓解。细胞回输后行血常规、肝肾功检查，未见明显变化。

表1 27例联合治疗患者治疗前后外周血T细胞表型变化(%，s，n=27)Tab.1 Changes of T-cell phenotype in peripheral blood of 27 patients before and after combination treatment (%,, n=27)

表1 27例联合治疗患者治疗前后外周血T细胞表型变化(%，s，n=27)Tab.1 Changes of T-cell phenotype in peripheral blood of 27 patients before and after combination treatment (%,, n=27)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with before treatment

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3 讨 论

肾癌作为一种恶性泌尿系肿瘤，其发病率在近年持续攀升，腹腔镜肾癌根治术是当前治疗肾癌的一项基本手段，尤其对于非转移性肾癌是首选方案，但术后仍有一定的复发、转移率，尤其是临床Ⅱ、Ⅲ期肾癌，术后50%～70%出现转移[4]，无远处转移患者的5年存活率为50%～95%，发生转移的患者存活率则降至5%[2]。由于肾癌细胞存在多药耐药基因-1及其产物P-糖蛋白的过度表达，因此对化疗药物几乎普遍抗拒，对放疗亦不敏感。既往细胞因子治疗有效率低，不良反应重，且大多无法持久。

索坦是三磷腺苷的强效竞争性抑制剂，可抑制多个受体酪氨酸激酶(RTK)，其中某些RTK参与了肿瘤生长、病理性血管形成和肿瘤转移的过程[7]。索坦的作用靶点包括血小板衍生生长因子受体(PDGFRα和PDGFRβ)、血管内皮生长因子受体(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、干细胞因子受体(KIT)、Fms样酪氨酸激酶-3(FLT3)、1型集落刺激因子受体(CSF-1R)和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子受体(RET)[5,8]。

体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法是目前一种热门的肿瘤治疗方法。CIK兼具T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤细胞的功能，且体内外增殖能力强，是一类杀瘤活性和杀瘤谱更强的新型抗肿瘤效应细胞。DC是迄今为止已知体内作用最强的抗原提呈细胞，其表面高表达MHC分子和各种共同刺激分子(如CD80和CD86)，可高效增殖活化未致敏T细胞，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸。此外，DC还可通过直接或间接方式影响B细胞的增殖，活化体液免疫应答[9]。DC+CIK细胞回输可以直接杀伤肿瘤，亦可间接诱导机体的自身免疫系统杀伤肿瘤，调节并增强机体的免疫功能，从而产生持续的抗肿瘤作用[10]。DC的发育分化过程伴随着其由未成熟的前体细胞向成熟细胞的转变，未成熟的DC(immature DC，imDC)与成熟DC(mature DC，mDC)在表型特征以及生物学功能上都有区别，imDC的最大特点是在体外可诱导T淋巴细胞特异性低应答。快速生长的肿瘤会持续分泌IL-10、VEGF、TGF-β等细胞因子，使浸润于其中的DC持续处于未成熟状态，这些存在于肿瘤周围的未成熟DC不但会诱导机体对肿瘤产生免疫耐受，而且会促进内皮细胞定植并分化，诱导肿瘤新生血管形成。靶向治疗联合细胞治疗的效果要好于单纯靶向治疗的原因可能在于靶向药物(如索坦、索拉菲尼等)同时抑制了多条信号传导通路，具有抗肿瘤和抗血管生成作用，使肿瘤微环境发生改变，抑制了相应趋化因子的产生，使部分imDC成功转变为mDC从而发挥其抗原呈递功能，诱导机体产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，识别和杀伤肿瘤细胞；通过分泌C干扰素(IFN-C)等细胞因子从而抑制肿瘤血管生成；同时激发免疫记忆保护，在宿主再次受到肿瘤细胞攻击时发挥保护作用。肿瘤靶向治疗的同时可能也产生免疫治疗的作用，因此疗效更明显。

Hwang等[11]回顾性分析了21例使用索坦治疗的转移性肾癌患者的临床疗效，中位PFS为13.4个月，中位OS为28.1个月。本组27例转移性肾癌患者经靶向药物联合DC+CIK细胞治疗后，中位PFS为16个月，与之前报道相比有所提高，而OS尚未得出，说明联合治疗可延长患者疾病无进展时间；T细胞CD4+、CD8+和CD3+百分数较治疗前明显提高，而外周血T细胞亚群CD4+、CD8+和CD3+是体现患者细胞免疫情况的重要指标。该结果提示经联合治疗后患者免疫功能得以改善。KPS评分总提高率为74.1%，提示联合治疗对改善患者生存质量也有所帮助。

本组27例联合治疗的患者中，以Ⅰ-Ⅱ级药物不良反应为主，基本集中在靶向治疗期间，以乏力、手足综合征、高血压、血小板减少、甲状腺功能减低和中性粒细胞减少常见，经对症治疗可缓解，与之前索坦的常见不良反应报道相符。在免疫治疗期间，只有少数几例患者出现一过性发热和头晕现象，均能自行缓解。治疗过程中仅1例靶向药物减量，2例最终停药，提示患者对联合治疗有着良好的耐受性。

总之，在本研究中，索坦联合DC+CIK细胞治疗转移性肾癌的临床疗效较好，并可延长患者的疾病无进展时间，提高免疫功能，改善生存质量，耐受性较好，可能成为肾癌综合治疗的一条新途径。

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