丁香精油及丁香酚对食品腐败菌的抑菌活性研究

曾 荣，陈金印 ，林丽超

(1.佛山科学技术学院 食品与园艺学院，广东 佛山528200;2.江西农业大学 农学院，江西 南昌330045)

微生物广泛分布于自然界，食品在生产、包装、贮运及销售过程中，不可避免地会受到一定类型和数量的微生物污染。当环境条件适宜时，它们就会迅速生长繁殖，造成食品的腐败与变质。由于微生物侵染引起的食品腐败不仅降低了食品的营养和卫生质量，而且还可能危害人体健康，同时造成巨大的资源浪费和环境污染。在生产中一般要添加防腐剂来减少食品的腐败变质，延长货架期。目前使用最多的为化学防腐剂，如苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类、硝酸盐及亚硝酸盐、对羟基苯甲酸酯类等。长期的科学研究和生产实践证明，这些化学防腐剂大多具有潜在毒性和安全隐患。因此，天然无毒、高效安全的食品防腐剂的研究与开发成为各国食品生产者及科研工作者的研究热点［1］。

丁香(Eugenia caryophyllata)的干燥花蕾是我国传统的调味品和中草药，其性辛温，挥发油的主要成分为丁香酚(eugenol)，具有较强的杀虫、抑菌和防腐保鲜作用［2－5］。丁香酚是欧盟、美国及中国都允许使用的食品添加剂，由于对其抑菌谱及使用浓度尚未明确，其在食品工业并未得到广泛应用。本文旨在通过研究丁香精油及丁香酚对食品中常见的腐败菌的抑制活性及量效关系，为丁香精油和丁香酚作为天然食品保鲜剂的开发及食品活性包装提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种和培养基

沙门氏菌(Salmonella anatum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)由佛山市疾控中心提供。培养基为牛肉膏蛋白胨，参照周德庆［6］的方法配制。

1.2 丁香精油的制备及丁香酚

丁香购自江西省樟树市华丰药业公司，产地为广西。将材料于40 ℃烘干，粉碎，过40 目筛，取200 g 粉末加入超临界流体萃取釜中，萃取温度为40 ℃、压力15 MPa、萃取时间2 h。得到丁香精油42 g。丁香酚购自Sigma 公司。

1.3 主要仪器设备

FW100 干样粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)、SPX－250 型生化培养箱(上海楚定分析仪器公司)、SFE 超临界流体萃取仪(广州轻工研究所)、YXQ－LS－SⅡ全自动电热高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、AUY220 电子分析天平(日本岛津)、UV－2450 紫外可见分光光度计(日本岛津)、SpectraMax190 酶标仪(美谷分子仪器有限公司)。

1.4 菌液的制备

采用比浊法制备各种菌悬液。以上菌种经活化接种于试管斜面培养基培养(37 ℃，24 ～36 h)，用无菌水稀释，菌液的浓度控制在107～108cfu/mL，备用。

1.5 抑菌活性的测定

结合杯碟法和双层平板法测定提取液对供试菌生长的抑制作用［6］。先倒底层平板，再吸取10 mL制好的菌液，混入冷却至45 ℃左右90 mL 培养基中，使最终菌液浓度为106～107cfu/mL，制备上层带菌平板。凝固后在平板上对称放置无菌牛津杯，向牛津杯中加入200 μL 丁香精油或丁香酚，进行3 次平行实验，重复2 次。37 ℃培养24 ～36 h，十字交叉法测量抑菌圈的大小。以0.2%的苯甲酸钠为阳性对照(根据食品添加剂使用标准GB2760—2011)。

1.6 MIC 及MBC 的测定［7］

用微量稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)。将精油及丁香酚过0.22 μm 微孔过滤器，并用Tween －80 稀释。吸取100 μL 含菌培养基加入至96 孔板中，再加入100 μL 浓度为5～200 mg/L 丁香酚及丁香精油(梯度为5 mg/L)。置37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察菌体的生长情况，细菌生长完全被抑制时所对应最低药物浓度试验孔即为精油及丁香酚的MIC。继续培养24 h，观察菌体的生长情况，无菌生长的最低样品浓度即为MBC 值。

质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

1.7 毒力回归方程的测定

毒力回归方程的测定参照唐静等［8］的方法。

根据抑制率，查几率值表，可得抑制率几率值(Y)，将药液浓度(mg/mL)换算成浓度对数(X)，即可求出线性方程Y=aX+b，根据线性方程可求出抑制中浓度(IC50)。

1.8 数据统计分析

采用DPS v7.05 对数据进行统计分析，选择Ducan 新复极差法对实验数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 丁香精油及丁香酚对供试菌的抑菌效果

表1 丁香精油及丁香酚对供试菌的抑菌效果Tab.1 Antibacterial activity of clove essential oil and eugenol against the tested microorganisms

从表1 可以看出，丁香精油和丁香酚的抑菌谱广，对所试的腐败菌具有较强的抑制作用。除绿脓假单胞菌外，对其他菌的抑菌圈直径均为20 mm 以上。与0.2%的苯甲酸钠溶液相比，丁香精油及丁香酚对革兰氏阳性菌的抑制效果明显优于革兰氏阴性菌，特别是金黄色葡萄球菌及蜡样芽胞杆菌，抑菌圈直径超过30 mm，显著大于阳性对照苯甲酸钠的抑菌圈直径。丁香酚为丁香精油的主要成分，其对大肠杆菌、沙门氏菌及李斯特菌的抑制效果显著大于丁香精油。

2.2 丁香精油及丁香酚对供试菌的MIC 和MBC

表2 丁香精油及丁香酚对供试菌的MICTab.2 The MIC of clove essential oil and eugenol against the tested microorganisms

由表2 可知，丁香精油对金黄色葡萄球菌的MIC 最低，为20 μg/mL;其次为蜡样芽胞杆菌，MIC 为25 μg/mL;对绿脓假单胞菌的MIC 最高，为130 μg/mL。丁香酚对供试细菌的MIC 与丁香精油的MIC有较好的相关性，通过线性分析，其相关系数为0.866 1，说明丁香酚为丁香精油中的主要抑菌功效成分。对照苯甲酸钠的MIC 均在1 200 μg/mL 以上，根据国标2760—2011 中规定，苯甲酸钠在各类食品中的最大使用量为200 ～2 000 μg/g。

表3 丁香精油及丁香酚对供试菌的MBCTab.3 The MBC of clove essential oil and eugenol against the tested microorganisms

由表3 可以看出，非常低剂量的丁香精油和丁香酚即可完全抑制和杀死食品中的常见腐败菌，特别是革兰氏阳性菌。丁香精油和丁香酚具有芳香气味，其添加到食品中有可能破坏食品的原有风味，因此对其添加量要进行控制。通过试验结果可以发现，丁香精油和丁香酚对食品中常见腐败菌的MIC 和MBC 均较低，作为防腐剂的使用剂量并不需要很大，因此对食品风味的破坏可以减少到很低。

表4 丁香精油及丁香酚对供试菌的毒力回归方程Tab.4 The regression equation of clove essential oil and eugenol against the tested microorganisms

2.3 丁香精油及丁香酚对供试菌的毒力回归方程

通过测定丁香精油及丁香酚对食品中常见腐败菌的室内毒力，获得不同浓度处理对菌落生长抑制作用数据，用DPS 统计软件进行回归统计分析，得出以药剂浓度对数值为X，抑菌率几率值为Y 的毒力回归方程和IC50，其结果见表4。由表可知:丁香精油和丁香酚对金黄色葡萄球菌及蜡样芽胞杆菌的毒力最强，丁香精油的IC50分别为4. 383 2 μg/mL、5. 024 4 μg/mL，丁香酚则分别为4. 284 5 μg/mL、4.046 6 μg/mL。两种物质对绿脓假单胞菌的毒力最弱，IC50分别为26.532 4 μg/mL、25.609 4 μg/mL。

3 结论与讨论

随着食品工业的快速发展及人们消费观念的变革，食品安全成为亟待解决的重要问题。化学防腐剂如常用的亚硝酸盐在人体内可与仲胺类作用形成亚硝胺类，在体内达到一定剂量时是致癌、致畸、致突变的物质，可严重危害人体健康。因此，生产者和科研工作者都致力于研究和开发新型的、安全的食品防腐剂。植物精油是存在于植物体中一类具有芳香气味，在常温下能挥发，可随水蒸气蒸馏的油状成分，主要含有酯、醛、酮、酚和萜烯类等物质。许多植物精油被证实具有杀菌消炎、抗氧化的能力，是非常好的潜在食品防腐剂来源［9－11］。丁香精油的对许多微生物都具有抑制作用，且发现其能延长西兰花、黄花菜、草莓、葡萄、桃等果蔬的贮藏保鲜期［12－15］。Goñi 等［13］研究发现，丁香精油的气相部分对E.coli、S.aureus、L.monocytogenes、E.faecalis 具有抑制作用，当与桂皮精油混合使用时，对E.coli 的抑制存在拮抗作用，而对L.monocytogenes 等细菌存在协同作用。Shan 等［16］研究发现S. aureus 对酚类物质最为敏感，而E.coli 抗性最强。通过试验，笔者发现丁香精油及精油中主要成分丁香酚对食品中常见的腐败菌具有较强的抑制作用，金黄色葡萄球菌及蜡样芽胞杆菌对其非常敏感。

植物精油的抑菌作用早被发现，但在食品工业中作为防腐剂应用并不广泛，限制其发展的重要原因是:精油含有大量芳香性物质，具有浓郁的气味，当添加到食品中时容易破坏食品固有的风味［17－18］。解决的方法之一是使用复方精油，对两种以上的精油进行复配，减少使用量，从而降低对食品风味的影响;另外可找出精油中的活性功效成分，对其进行适当改性，使抑菌能力增强，亦能降低使用浓度。丁香酚即为丁香精油中的主要抑菌功效成分，尚需深入研究其抑菌机理及改性途径，为天然防腐剂的开发奠定基础。

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