五种免疫相关酶在不同年龄组中国大鲵组织内的分布及活性比较研究

原居林，辛建美，练青平，杨元杰，刘金殿，张爱菊

(浙江省淡水水产研究所，浙江 湖州313001)

中国大鲵(Andrias davidianus)俗称娃娃鱼，隶属于两栖纲(Amphibia )、有尾目(Caudata)1、隐鳃鲵科(Cryptobrachidae)、大鲵属(Andrias)，为我国特有的珍稀水生动物。大鲵是非常古老的物种，是地球生物演变的“活化石”，在研究地球演化、生物进化、环境变迁等方面具有重要的科学价值［1－2］。20 世纪以来，由于自然生境的破坏、饵料生物减少、非法捕杀，加之大鲵资源再生能力差等原因，野生大鲵资源量急剧下降，面临枯竭的危险。目前，野生大鲵种群仅存在于人类破坏活动难以涉及的石灰岩溶洞、地下阴河或山溪中。国际濒临绝种生物国际贸易公约(CITES)也将其列为国际极危野生物种，我国已将大鲵列为国家二级濒危野生保护动物。

为有效保护这一珍贵物种，多年来我国学者先后开展了中国大鲵人工繁殖、病害防治和规模化养殖技术等研究［3－5］，并取得了较大的进展。但近年来随着养殖集约化程度日趋提升，养殖密度不断增大，导致大鲵暴发性疾病日趋严重［6－8］，给养殖业带来了巨大的损失。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ATP)作为重要的免疫相关酶类，是评价外来物对水生生物机体损伤的重要生物学指标，疾病、药物、污染等因素均会不同程度地影响这些酶类的活性，目前关于大鲵免疫学方面的研究较少，仅见于沈国民等［9］分析了大鲵24 种组织碱性磷酸酶的特性和郑尧［10］介绍了大鲵表皮中存在着免疫相关酶组分。因此本文通过测定5 种抗氧化酶在3 个年龄组大鲵不同组织中的分布，揭示其抗氧化功能的主要组织，为今后大鲵这一濒危物种的保护和健康养殖提供理论支持。

护理前，实验组与参照组患者对糖尿病健康知识的了解评分均较低（P＞0.05）。经过为期3个月的护理干预，两组患者对疾病的了解评分均有所提高（P＜0.05）；且实验组患者的评分高于参照组（P＜0.05）。见表1。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验大鲵采自浙江省庆元山鼎大鲵研发有限公司，分别为1 龄、2 龄及3 龄大鲵各3 尾，测试前投喂活体泥鳅幼鱼进行暂养，暂养期间水温18 ～20 ℃，微流水养殖。

1.2 酶液制备

将活体大鲵放入－80 ℃冰箱中瞬间冷冻致死，然后进行解剖，取一定量的腹部表皮、肝脏、背部肌肉、肠道中段、胃组织样本在冰浴条件下匀浆，4 ℃2 000 r/min 离心获得酶液。

1.3 酶活性的测定

3 个不同年龄组大鲵组织中SOD 活性分布如图1 所示。从图1 中可知，3 个年龄组的大鲵SOD 活性大小依次表现为肝脏、表皮、胃、肠道、肌肉，其中肝脏SOD 活性显著高于其他组织，而肌肉中SOD 活性显著低于其他组织。不同年龄组大鲵特定组织中的SOD 活性也存在一定差异。除肌肉外，其他各组织1 龄组SOD 活性均高于2 龄组和3 龄组。

分别为印多尔：49%、密鲁特：36%、德里：30%、那格浦尔：22%、孟买：18%、海德拉巴：11%、金奈：6%、加尔各答：4%。（数据来源：印度全国家庭健康调查）

1.3.2 过氧化氢酶（ Catalase CAT） 活性测定 其活性单位定义为:每克血红蛋白中或每克组织蛋白中过氧化氢(CAT)每秒钟分解吸光度为0.50 ～0.55 的底物中的过氧化氢相对量为一个过氧化氢酶的活力单位。

1.3.4 碱性磷酸酶（ AKP） 活性测定 其活力单位定义为:每克组织蛋白在37 ℃与基质作用15 min 产生1 mg 酚为一个活力单位。

这些编码方法具有一定的主观性，但研究目的只是借波特一致性系数以说明标准与试卷a的一致性是否比试卷b好，编码标准是一致的，能降低影响，当然如果有更多的人参与到编码中，可以降低主观性.

1.3.3 谷胱甘肽过氧化物酶（ Glutathione peroxidase，GPx） 活性测定 其活性单位定义为:每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH 浓度降低1 μmol/L 为一个酶活力单位。

1.3.5 酸性磷酸酶（ ACP） 活性测定 其活力单位定义为:每克组织蛋白在37 ℃与基质作用30 min 产生1 mg 酚为一个活力单位。

考虑到图像内外局部灰度的差异，我们提出了一种新的快速自适应活动轮廓模型来解决这些限制，相比现有的模型，本文做出了以下贡献：第一，本文首次将轮廓内外局部灰度的差异加入至能量泛函，当两者灰度差异很大时，即演化曲线逼近图像边缘时，减缓曲线演化速度，反之，加速曲线演化；第二，本文应用邻域平均算子计算局部邻域灰度均值，在表达局部图像信息的同时，又对图像进行了一定的平滑，消除了部分噪声和灰度不均匀对分割结果的影响。第三，本文将内外轮廓局部邻域的匀质性差异代替λ1、λ2作为内、外局部能量参数值的控制项，解决了模型对参数敏感这一问题，同时还提高了曲线的演化效率。

1.1 一般资料 以2011年1月至2016年1月在伊犁哈萨克自治州友谊医院行胸腰椎结核手术的186例患者为研究对象，回顾性收集其各项资料。其中，哈萨克族97例，其他民族89例；男112例，女74例；年龄25～56岁，平均(41.25±4.63)岁；129例患者病变累及1个或2个节段，57例患者病变累及3个及以上节段；病程2～27个月，平均(11.32±4.93)个月。

1.4 数据处理

采用spss13.0 对3 个年龄组不同组织免疫相关酶活性进行显著分析。

2 结果与分析

2.1 不同年龄组大鲵组织中SOD 的分布及活性

5 种酶活性均采用购自南京建成生物有限公司的试剂盒进行测定。

1.3.6 蛋白测定 所有组织蛋白浓度均采用考马斯亮兰法测定，具体操作参照南京建成生物有限公司的试剂盒进行。

橘红是被迫走的，她并不想离开滨湖。杨琳说，橘红和她分手告别时，流了眼泪。何牦只要站在临湖广场这个昔日的码头上，仿佛就看了橘红流着两串长长的泪水，依依不舍走向四层客轮。滨湖是她的伤心之地，为何还这样依依不舍？对滨湖她有什么不舍？一定是为了他，为了他这个不争气的胆小男人。橘红早预料到这一走难能相见。

图1 SOD 在不同年龄组大鲵各组织中的分布及活性Fig.1 The separation and activities of SOD in Andrias davidianu at different ages

图2 CAT 在不同年龄组大鲵各组织中的分布及活性Fig.2 The separation and activities of CAT in Andrias davidianu at different ages

图3 GPx 在不同年龄组大鲵各组织中的分布及活性Fig.3 The separation and activities of GPx in Andrias davidianu at different ages

图4 AKP 在不同年龄组大鲵各组织中的分布及活性Fig.4 The separation and activities of AKP in Andrias davidianu at different ages

图5 ATP 在不同年龄组大鲵各组织中的分布及活性Fig.5 The separation and activities of ATP in Andrias davidianu at different ages大写字母表示同一年龄组不同组织酶活力差异，小写字母表示不同年龄组同一组织酶活力差异，相邻字母表示差异显著(P ＜0.05)，相间字母间表示差异极显著(P ＜0.01)。Capital letters indicated enzyme activity of different tissues at the same age group，lowercase indicated enzyme activity of different age groups at the same tissue. Adjacent letters indicated difference(P ＜0.05)，interval letters indicated significantly difference(P ＜0.01).

2.2 不同年龄组大鲵组织中CAT 的分布及活性

3 个不同年龄组大鲵组织中CAT 活性分布如图2 所示。从图2 中可知，3 个年龄组的大鲵CAT 活性大小依次表现为表皮、肝脏、胃、肠道、肌肉，其中表皮和肝脏CAT 活性显著高于其他组织，而肌肉中CAT 活性则显著低于其他组织。不同年龄组大鲵特定组织中的CAT 活性也虽有一定差异，但未达到显著程度，除肌肉外均呈现1 龄组活性均高于2 龄组和3 龄组。

1.3.1 超氧化物歧化酶（ Superoxide Dismutase SOD） 活性测定 其活性单位定义为:在30 ℃下，每毫克组织蛋白在1 mL 反应液中SOD 抑制率达到50%时所对应的SOD 量为一个SOD 单位(U/mg protein)。

2.3 不同年龄组大鲵组织中GPx 的分布及活性

3 个不同年龄组大鲵组织中GPx 活性分布如图3 所示。从图3 中可知，3 个年龄组的大鲵GPx 活性大小依次表现为肝脏、表皮、肠道、胃、肌肉，其中肝脏GPx 活性显著高于其他组织，而肌肉中GPx 活性显著低于其他各组织。不同年龄组大鲵特定组织中的GPx 活性存在一定差异。例如3 龄大鲵肝脏中GPx 活性显著高于1 龄和2 龄，而其他年龄组大鲵各组织GPx 活性却未达到显著差异程度。

2.4 不同年龄组大鲵组织中AKP 的分布及活性

3 个不同年龄组大鲵组织中AKP 活性分布如图4 所示。从图4 中可知，3 个年龄组的大鲵AKP 活性大小依次表现为表皮、肝脏、肌肉、肠道、胃，其中表皮中AKP 活性显著高于其他组织。不同年龄组大鲵特定组织中的AKP 活性存在一定差异，且除肠道外均差异显著。

2.5 不同年龄组大鲵组织中ATP 的分布及活性

3 个不同年龄组大鲵组织中ATP 活性分布如图5 所示。从图5 中可知，1 龄和3 龄组大鲵ATP 活性大小依次表现为肝脏、肠道、肌肉、胃、表皮，2 龄大鲵ATP 活性大小依次表现为肠道、肝脏、肌肉、胃、表皮，其中表皮中AKP 活性显著低于其他组织。不同年龄组大鲵特定组织中的AKP 活性存在一定差异，除肝脏外均差异显著。

3 讨论

细胞代谢过程中会产生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，在正常生长和代谢情况下，细胞内活性氧的产生和清除处于一种动态平衡。当活性氧产生与清除失衡时，就导致氧化胁迫，活性氧使生物大分子、生物膜遭到可逆及不可逆损伤，严重时可引起细胞死亡［11］。生物体在长期的进化过程中，形成了一套抗氧化系统来清除体内多余的活性氧，包括非酶类抗氧化剂和酶类抗氧化剂，前者如维生素E、谷胱甘肽、β－胡萝卜素等;后者主要有3 种:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。SOD 和CAT 是生物体细胞内清除O2－等自由其以用分解H2O2的重要酶类，已有的研究表明这两种酶的活性与生物体细胞免疫防御能力密切相关。因机体不同组织表现出的免疫功能有所不同，因此决定了SOD 和CAT 在机体各组织中表现出不同的活性，并随着机体的生长活性也有所变化。李文英等［12］实验表明斑马鱼(Brachydanio rerio)不同组织中活性差别较肝脏和鳃中SOD 酶活性分别为(41.86 ±3.28)和(10.75 ±0.87)U/mg。卢彤岩［13］等报道了哲罗鲑(Hucho taimen)不同组织SOD和CAT 活性，表明CAT 和SOD 均在肝脏中表现为最高活性。王荻［14］等对小体鲟(Acipenser ruthenus)、西伯利亚鲟(Acipenser baerii Brandt)及杂交鲟I 和杂交鲟II 4 个群体的肝、肾、鳃、肌肉和血液组织中免疫相关的超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)的活性分布进行了比较研究。本研究通过分析1龄、2 龄和3 龄大鲵5 种组织中SOD 和CAT 酶活力分布，发现SOD 在肝脏中活力最强，CAT 在表皮中活力最高，肝脏中其次，且随着年龄的增长CAT 及SOD 活性下降。这表明肝脏和表皮是大鲵较为重要的免疫器官，尤其是在生长初期。随着大鲵的生长和机体免疫系统的趋于完善，肝脏和表皮免疫功能逐步减弱。

磷酸酶是磷代谢过程中的重要酶类，在营养物质的消化、吸收和运转过程中起重要作用，也是动物体内重要的解毒体系［17］。碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ATP)作为2 种重要的机体功能调节酶，其活力是细胞和体液免疫的综合体现，也是衡量免疫功能和机体状态的指标，反映了机体对外源微生物侵染的防御能力。沈国民［9］等分析了大鲵24 种组织碱性磷酸酶的特性，发现200 KD 和230 KD 的碱性磷酸酶在心脏活性最高。卢彤岩［13］等研究表明，AKP 和ATP 在不同大小哲罗鱼组织内表现活性不同。Broeg K［18］等认为鱼类肝脏巨噬细胞的吞噬活性高低可以以肝脏中酸性磷酸酶作为一个主要指标。本研究结果表明，AKP 和ATP 在大鲵的各组织中均有一定的分布，但表现为不同的活力，且活性与年龄有不同的关系，这也说明AKP 与ATP 不仅与机体免疫相关，也参与了机体的生长代谢。

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