慢病毒载体介导的RNAi双敲除ABCG2和UGT1A1的Caco-2细胞模型

龚淑敏 ，李光明，董莉真，吴志敏，程 彬，张 斌，朱 泽

（1.天津市第四医院内科，天津 300222；2.天津医科大学病原生物学教研室，天津 300070）

用化学合成的siRNA 抑制Caco-2 细胞的UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6 和UGT2B7，显示UGT1A1在蛋白表达和活性方面都有明显的下降，但其抑制作用较短暂，不利于药物长期效果的吸收代谢评价[1]。先前我们已成功构建了以慢病毒载体介导的RNAi干扰ABCG2 基因的Caco-2 细胞模型[2]。在此研究基础上，设计合成了慢病毒介导的靶向ABCG2 和UGT1A1 基因的RNAi 干扰颗粒，首先分别检测了慢病毒ABCG2 和慢病毒UGT1A1 单基因干扰效率；然后检测了RNAi 干扰ABCG2 和UGT1A1 的双基因RNAi 干扰效率；并进行了RNAi 干扰ABCG2，UGT1A1 基因先后不同顺序的效果比较。在未来肠道ABCG2 和UGT1A1 对口服抗癌药物吸收与代谢联合作用下药代动力学评价中，提供稳定可靠的RNAi 干扰双基因的Caco-2 细胞模型。

1 材料和方法

1.1 试剂 DMEM 培养基、胎牛血清购自HyClone公司；HEPES，D-葡萄糖，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸购自Sigma 公司；Lipofectamine 2000；Trizol 购自Invitrogen 公司；BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶，SYBRgreenPCRkit，RT-PCRkit 购自TAKARA 公司。

1.2 细胞培养 Caco-2 TC7 细胞由美国University of Houston，Hu Ming 教授惠赠，是Caco-2 的亚克隆细胞。于含有HEPES、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、抗生素和10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养，均在37℃、5%CO2条件下进行。

1.3 慢病毒载体的构建

1.3.1 shRNA 寡核苷酸链的设计合成和质粒载体的构建 UGT1A1 基因cDNA 的3个序列和选择前期验证的ABCG2 基因cDNA 的序列分别作为靶位点ABCG2：sh2 GGACATCATTAATGGAGATTC；UGT1A1：sh1 GCTGGTTCCCATGGTGT-TTAT；UGT1A1：sh2GGTGTTTATGAAAGCATATGC；UGT1A1：sh3 GCAAAGCGCATGGAGACTAAG。设计合成相应的互补的shRNA 寡核苷酸单链，同时设计合成一对不靶向任何基因的shRNA 寡核苷酸单链shRNA/Negative 作为对照。shRNA 中包含酶切位点（BamHⅠ）、针对靶序列的干扰序列、loop 环、干扰序列的反向互补序列、中止信号（TTTTTTCCAA）和酶切位点（XhoⅠ）。互补的shRNA 寡核苷酸单链经退火形成双链，与BamHⅠ和XhoⅠ酶切后的质粒载体连接，分别构建成pRNAT-u6.2/Negative、pRNAT-u6.2/ABCG2 和pRNAT-u6.2/UGT1A1 质粒载体。

1.3.2 慢病毒载体的包装和滴度测定 用胰蛋白酶消化对数生长期的293T 细胞，以0.5×106/mL 的细胞密度接种[1]，主要制备三质粒DNA：7.5μg 包膜质粒pMD2G，15μg 包装质粒pCMV 和20μg 转染质粒pRNAT-u6.2。与转染试剂Lipofectamine 2000混合，并转染293T 细胞，于37℃，5%CO2培养箱中培养12 h，PBS 液漂洗后加含10%血清的细胞培养液继续培养48 h，收集细胞上清液。超速离心后即得到病毒液LV-ABCG2-sh2 和LV-UGT1A1-sh1～sh3。同法获得阴性对照病毒液LV-Negative-sh。以每管10μL 分装病毒液置于-70℃冰箱中保存。

1.3.3 慢病毒滴度测定 接种Hela 细胞于24 孔板，每孔5×104细胞，培养24 h 后，将病毒液倍比稀释感染细胞。72 h 后提取DNA，用Real-time PCR检测前病毒DNA 来测定病毒滴度（TU/mL）。

1.4 慢病毒感染Caco-2 细胞

1.4.1 慢病毒载体介导的ABCG2、UGT1A1 单基因RNAi 干扰 接种Caco-2 细胞于6 孔板，每孔5×105细胞，分为空载体慢病毒Lv-Negative-sh、干扰慢病毒（LV-ABCG2-sh2 和LV-UGT1A1-sh1～sh3）共5组，每组3 孔细胞。培养3 d 后，根据病毒滴度取适量体积的病毒原液，使病毒的感染复数（multiplicity of infection，MOI）为3，混合病毒液加到细胞上，每孔加入1.5 mL 病毒液与终浓度为10μg/mL的Polybrene。37℃，5%CO2培养24 h 后吸去病毒液，换完全培养基继续培养。感染第5 天收集细胞，检测ABCG2、UGT1A1 mRNA 和蛋白的表达。检测后，在病毒LV-UGT1A1-sh1～sh3 中选取敲除效率最高的一种病毒，用于双干扰实验。

1.4.2 慢病毒载体介导的ABCG2、UGT1A1 双基因RNAi 干扰 先感染ABCG2（或UGT1A1）病毒，24 h后吸去病毒液，换完全培养基继续培养24 h，再感染另一种病毒，第二种病毒感染第5 天收集细胞并检测，同样方法对照组用空载体病毒感染两次。

1.5 RT-PCR 和Real-time PCR 检测 用TRIzol 提取细胞总RNA，以Random为逆转录引物，按TAKARA 公司RT-PCR 试剂盒合成cDNA，PCR 扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。以cDNA为模板，按照SYBR green PCR kit 试剂盒进行Real-time PCR 检测，扩增条件为：预变性95℃10 min；95℃，15 s，55℃，30 s，72℃，30 s，40个循环。β-actin 作为内参对照。ABCG2、UGT1A1 和β-actin 的PCR 引物为ABCG2：Forward TTAGCTGCAAGGAAAGATC，Reverse GAGTTCCAACCTTGGAGTC；UGT1A1：Forward TGCCATGCAGCCTGGAATTTG，Reverse AGATGCAGAGCTCAATAGGTCC；β-actin：Forward GCGAGAAGATGACCCAGCTC，Reverse CCAGTGGTACGGCCAGAGG。

1.6 Western blotting 检测 细胞裂解液冰上裂解细胞，收集上清作为样品。半干转法将蛋白转移至PVDF 膜，100V，2 h。封阻液封闭过夜，TBST 洗膜后孵育特异性抗体，1∶1 000 稀释的一抗：anti-ABCG2（antibody 6D170）和anti-UGT1A1（antibodyD-16）。1∶5 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗：羊抗鼠IgG（ABCG2），驴抗羊IgG（UGT1A1）。Tubulin 作为内参对照。ECL Western blotting 检测试剂盒（Amersham，UK）显色，暗室曝光显影。

2 结果

2.1 慢病毒载体包装和滴度测定 三质粒系统转染293T 细胞12 h，荧光显微镜下观察到293T 细胞中表达绿色荧光，证实了GFP 基因的表达。转染48 h 再观察，发现细胞中荧光强度较转染12 h 时有所增强，由此慢病毒载体由293T 细胞包装产生。通过Real-time PCR 检测前病毒DNA 的表达，测定出病毒滴度分别为LV-ABCG2-sh2：1.2×108TU/mL，LV-UGT1A1-sh1：1.7×108TU/mL，LV-UGT1A1-sh2：0.8×108TU/mL，LV-UGT1A1-sh3：1.2×108TU/mL。根据病毒滴度分别计算所需病毒原液的体积，使病毒对细胞的感染复数MOI为3。

2.2 RT-PCR 和Real-time PCR 检测Caco-2 细胞中ABCG2 和UGT1A1 mRNA 的表达 RT-PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析。Real-time PCR 检测结果显示，与空载体病毒对照组比较，LV-ABCG2-sh2感染的细胞组ABCG2 表达量下调75%，LVUGT1A1-sh1，2，3 感染的细胞组UGT1A1 表达量分别下调3%、8%、88%（图1 A，B）。

2.3 Western blotting 检测Caco-2 细胞中ABCG2和UGT1A1 蛋白的表达 与空载体慢病毒对照组比较，重组慢病毒载体LV-ABCG2-sh2 和LVUGT1A1-sh1，2，3 能够在蛋白水平分别抑制ABCG2 和UGT1A1 的表达（图2A，B），而且两基因在蛋白水平的下调趋势与在mRNA 水平的变化趋势一致。

图2 Western blotting 检测重组慢病毒介导shRNA 在Caco-2 细胞的ABCG2 和UGT1A1 蛋白表达Fig 2 Western blotting show ABCG2 and UGT1A1 knockdown in Caco-2 cells

RT-PCR、Real-time PCR 和Western blotting 结果表明，3 种UGT1A1 基因重组慢病毒shRNA 均可不同程度抑制该基因的表达，其中LV-UGT1A1-sh3 具有靶向UGT1A1 最高的抑制效率。

2.4 同时敲除ABCG2 和UGT1A1 的Caco-2 细胞模型的构建 选取具有最高抑制效率的重组慢病毒LV-ABCG2-sh2 和LV-UGT1A1-sh3 依次感染Caco-2 细胞。Real-time PCR 和Western blotting 分别检测感染两种包装病毒的Caco-2 细胞中两基因的表达，结果显示：双基因RNAi 干扰Caco-2 细胞中ABCG2 和UGT1A1 的mRNA 和蛋白的表达水平与单基因干扰的Caco-2 细胞中的基因表达水平基本相同。ABCG2，单基因干扰效率75%（图2A），双基因干扰效率（先）72.3%，（后）69.7%；UGT1A1，单基因干扰效率88%（图2B），双基因干扰效率（先）88.7%，（后）85.7%（图3A，B）。ABCG2 与UGT1A1基因的干扰顺序与最终双干扰效果无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

在先前对ABCG2 靶向性干扰研究的基础上[2]，本研究中我们应用靶向ABCG2 和UGT1A1 基因的重组慢病毒感染Caco-2 细胞，成功构建了稳定敲除ABCG2 和UGT1A1 双基因的Caco-2 细胞。分别验证了在单敲除细胞中重组慢病毒LV-ABCG2-shRNA，LV-UGT1A1-shRNA 和双敲除Caco-2 细胞中两种基因分别在mRNA 和蛋白水平对ABCG2 和UGT1A1 的表达抑制和干扰能力。LV-ABCG2-shRNA 和3 种LV-UGT1A1-shRNA 之间敲除效率的不同，可能是由于靶向同一基因的不同靶区域而设计的shRNA 序列不同[3]；此外mRNA 二级结构的不同可能导致RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）在识别靶基因时的效率不同，从而产生不同的shRNA 敲除效率[4]，这是导致ABCG2 和UGT1A1 两种基因间的敲除效率不同的原因之一。选取具有最高敲除效率的重组慢病毒LV-ABCG2-sh2 和LV-UGT1A1-sh3，先后感染Caco-2 细胞并成功获得双敲Caco-2 细胞。在双敲Caco-2 细胞中ABCG2 和UGT1A1 的mRNA 和蛋白的表达水平与单敲的Caco-2 细胞中的基因表达水平基本相同，该结果与逆转录病毒介导的RNAi双敲的报道结果一致[5]，说明感染一种慢病毒的Caco-2 细胞接受第二种病毒感染的能力与未处理细胞接受第一次慢病毒感染的能力基本是相同的，为今后针对同一对象的不同靶点感染提供了实验支持。

Caco-2 细胞中的吸收和转运等功能是由多基因共同作用的级联反应来完成，既往研究主要干扰1个关键基因，现趋势为研究干扰多个位点上的相关基因，慢病毒为此提供技术上的可能。已有报道用化学合成的siRNA 或质粒来瞬时抑制多个基因[6-7]，也有研究者用腺病毒介导的RNAi 成功双敲两个基因[8]，近来有报道用慢病毒介导的RNAi 双敲细胞周期蛋白D1 和D2[9]。这些双敲的两个基因都属于同类基因，且其蛋白定位于细胞的相同部位。在本研究中ABCG2 和UGT1A1 分别属于两个不同家族，ABCG2 定位于肠细胞的绒毛膜面，能够把葡糖醛酸化的代谢物转运至肠腔，其又与抗肿瘤治疗的耐药机制关系密切[10-11]；UGT1A1 是化学物质进行Ⅱ相生物转化时最重要的一类酶，定位于细胞微粒体中，能催化葡萄糖醛酸与其相应底物结合生成亲水性代谢产物，处于UGT1A 家族第一外显子13个功能蛋白中，可以催化胆红素[12]、炔雌醇[13]、伊立替康[14]等内源和外源化学物质，是抗肿瘤药物代谢家族基因中的重要成员。ABCG2 是ABC 转运蛋白家族位于Caco-2 细胞的细胞壁，UGT1A1 是II 代谢酶UGT家族位于Caco-2 细胞质中的微粒体。本研究是第一次用慢病毒介导的RNAi 双敲细胞壁和细胞质中分属不同家族的两个基因所表达的蛋白。

综上，笔者应用分别靶向ABCG2 和UGT1A1基因的重组慢病毒感染Caco-2 细胞，第一次成功构建了持久、稳定敲除ABCG2 和UGT1A1 两基因的Caco-2 细胞模型。该细胞系可用于体外研究肠道中ABCG2 和UGT1A1 对口服药物或外源化合物吸收和代谢的联合作用。对于口服药物的筛选，提高营养物质的口服生物利用度和逆转多药耐药等研究具有重要意义。

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