纳米与超细二氧化钛和氧化锌颗粒致突变性的比较研究

王 艳 李小林 蒋 静 邱 璐

（上海出入境检验检疫局 上海 200135）

1 前言

近年来，纳米技术快速发展，已经在食品、化妆品、包装材料、环境治理等各个领域得到广泛应用，纳米材料也被誉为是“21世纪最有前途的材料”。 由于纳米氧化锌（ZnO）和纳米二氧化钛（TiO2）颗粒表现出众多优良的特性，已成为许多科学家研究的热点。纳米ZnO因其表面效应、体积效应、量子尺寸效应及其高吸收率等优良特性，在磁、光、电、催化等方面具有常规ZnO所无法比拟的性能和用途[1-2]；纳米TiO2俗称纳米钛白粉，颗粒尺寸在1-100纳米，也具有比表面积大、表面张力大、熔点低、磁性强、吸收紫外线能力强等特点。

纳米ZnO和纳米TiO2都是非常不错的光催化剂，纳米ZnO对UVA（长波320-400 nm）和UVB（中波280-320 nm）均有屏蔽作用；纳米TiO2对短波区190-280 nm、中波区280-320 nm、长波区320-400 nm三个区域内均表现出优异的吸收性能。由于它们无毒、无味、对皮肤无刺激性，不分解、不变质，热稳定性好，价格便宜，其本身为白色，可以简单地加以着色，用作化妆品的防晒剂[3]。

但是，随着纳米ZnO和TiO2的广泛应用，人类与其接触的机会越来越多，它们对人体健康和生态环境的潜在影响逐步受到人们的关注。2012年9月，欧洲消费者安全科学协会（SCCS）发表了一份指南文件，内容针对化妆品中纳米材料安全评估，其中提到，目前针对纳米物质的研究主要着眼于性质和特性等方面，但是缺乏针对纳米物质特殊的安全性评价方法，这恐怕是目前国际范围亟待解决的问题。SCCS同时也发布了这样的评价结论：基于目前的数据，防晒化妆品中，低于25%含量以下的非纳米级ZnO，经皮涂敷以后不会造成不良反应。然而非纳米级ZnO经口或经吸入后不会造成不良反应的最高含量，目前仍未有更多的实验结果以支撑，其安全范围（MoS）尚不确定。指南中还指出，ZnO目前还作为着色剂应用于化妆品中。基于纳米和微粒ZnO具有相似的毒理学特性，可以认为ZnO作为化妆品中的着色剂经皮涂敷是安全的，然而经口或者经吸入的安全性还未知，其MoS尚不明确。

由于物质达到纳米级时不但理化特性会发生改变，其生物学效应也可能发生改变。如有研究报道，当粒径达到纳米级时，一些原本无毒或者低毒的材料其毒性可能明显增强[4]。但目前关于纳米光化学催化材料的致突变性和安全性的研究报道仍很少，为此本研究采用Ames试验方法对纳米和超细ZnO和TiO2细颗粒的致突变性进行研究，比较TiO2和ZnO不同粒径下致突变性的差异。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验样品

纳米ZnO（50±10 nm，纯度≥99.5%）、超细ZnO（500 nm，纯度≥99.8 %）、纳米TiO2（25 nm，纯度≥99.0 %）、超细TiO2（500 nm，纯度≥99.0 %）：均购自杭州万景新材料有限公司。

2.1.2 试剂

阳性对照诱变剂——2-氨基芴（2-AF）、甲基甲烷磺酸酯（MMS）、生物素、四环素、辅酶II、6-磷酸葡萄糖、组氨酸：购自Sigma公司；叠氮钠（NaN3）：国药集团上海化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液、氯化钾、氯化镁溶液、20%葡萄糖溶液、营养肉汤、顶层培养基、底层培养基、VB培养基和肝微粒体代谢活化系统S9溶液：由本实验室配制。

2.1.3 试验菌株

标准测试菌株TA 9 7、TA 9 8、TA 1 0 0和TA102：由日本Japan Health Science Foudation HSRRB 提供。这些菌株按照GB15193.4-2003的方法进行如下鉴定：①组氨酸缺陷试验（his-）；②脂多糖屏障缺陷鉴定（rfa突变）；③对紫外线敏感性鉴定（uvrB修复缺陷型的鉴定）；④氨苄青霉素抗性试验；⑤四环素抗性试验；⑥自发回变数（his+）。菌株经鉴定合格后使用。

2.2 方法

2.2.1 Ames试验

试验前将纳米和超细ZnO和TiO2颗粒经高压灭菌消毒。正式试验前用超声清洗器进行超声振荡15min后用于试验。各纳米材料分别设立5个剂量组，其中纳米和超细ZnO颗粒均设置每皿5、10、25、50、100 μg 5个剂量组；纳米和超细TiO2设置每皿5、10、20、100、500 μg 5个剂量组。以平板掺入法进行检验。每个剂量组均做3个平行样，整个试验重复2次。具体操作如下：将含组氨酸生物素溶液的顶层培养基2 mL分装于试管中，45 ℃水浴保温，然后每支试管依次加入样品稀释液0.1 mL、试验菌株肉汤培养物0.1 mL和S9混合液0.5 mL（需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层培养基，转动平板，使之分布均匀。待凝固后倒置于37 ℃培养箱孵育，48 h计数每皿回变菌落数。试验以蒸馏水为阴性对照，以叠氮钠、2-氨基芴和甲基磺酸甲酯为阳性对照。

2.2.2 结果判定

记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）组、溶剂对照组以及阳性诱变剂对照组的每皿回变菌落数，以均数±标准差（± S）表示。以受试物的回变菌落数为溶剂对照回变菌落数的2倍或2倍以上，且呈剂量-反应关系者，判定为致突变阳性。受试物经上述4个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门菌为致突变阳性。如果受试物经4个试验菌株检测后，无论在加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。

3 结果

3.1 纳米和超细TiO2颗粒对鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102诱变回复突变的影响

试验结果见表1。表1显示，纳米和超细TiO2在加入S9和不加S9情况下对TA97、TA98、TA100、TA102的诱变回复突变数与阴性对照组相比无统计学差异，不同剂量的纳米和超细TiO2无剂量-效应关系。结果表明，纳米和超细TiO2对上述4个菌株无致突变性。

表1 纳米和超细TiO2颗粒的回复突变菌落数（± S）

表1 纳米和超细TiO2颗粒的回复突变菌落数（± S）

TA97 TA98 TA100 TA102 S9（-） S9（+） S9（-） S9（+） S9（-）S9（+）S9（-）S9（+）蒸馏水 / 106±3 112±12 33±2.6 35±5 132±5 138±10 232±14 245±15组别 剂量（μg/皿）nano- TiO2 5.0 104.7±14.0 107.0±2.6 35±4 47.3±4.5 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 102.3±3.5 106.7±1.5 35±5 46.0±5.3 135±12 149±3 246±4 214±6 20.0 103.0±2.0 102.7±3.2 33±3 46.3±2.3 163±20 136±15 246±4 275±32 100.0 101.7±4.7 111.0±4.0 34±4 35.3±4.5 147±8 162±14 243±7 247±48 500.0 110.0±2.0 114.7±14.6 30.3±2.08 46.7±2.1 184.7±2.1 183.7±1.5 245±1 284±14 micro-TiO2 5.0 112±4.7 123±6.1 35±4 47.3±4.5 138±21.1 147±24 265.3±37.2 276±25 10.0 100±10 123±7.5 35±5 46.0±5.3 142±11.6 166±1.73 256.3±22.1 260.3±14.5 20.0 115.7±12.5 122±16 33±3 46.3±2.3 150±6 156.7±14.6 274±27.6 256.7±9.7 100.0 111±11.5 114±5.3 34±4 35.3±4.5 152.3±17 164±6.7 279±22.7 258±37 500.0 118±2 122±6.4 31.7±3.8 46.7±2.1 155.7±2.1 172±7.2 223.7±25.1 236.3±36.2 NaN3 1 － － － － 1580.0±120. 0* － － －2-AF 20 － 1566.7±100.2* － 1306.7±120.6* － 1536±324* － －MMS 1 － － － － － － 802.7±3.8* －

3.2 纳米和超细ZnO颗粒对鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102诱变回复突变的影响

试验结果见表2。表2显示，纳米和超细ZnO颗粒在加入S9和不加S9情况下对TA97、TA98、TA100、TA102的诱变回复突变数与阴性对照组相比均无统计学差异，0-100μg/皿剂量范围内纳米和超细ZnO均没引起上述4个菌株的回复突变数的明显增加，未表现出明显的剂量-效应关系。结果表明，在加入和不加入S9情况下，纳米和超细ZnO颗粒对TA97、TA98、TA100、TA102无致突变性。

表2 纳米和超细ZnO颗粒的回复突变菌落数（± S）

表2 纳米和超细ZnO颗粒的回复突变菌落数（± S）

TA97 TA98 TA100 TA102 S9（-） S9（+） S9（-） S9（+） S9（-）S9（+）S9（-）S9（+）蒸馏水 / 106±3 112±12 33±2.6 35±5 132±5 138±10 232±14 245±15组别 剂量（μg/皿）nano- ZnO 5.0 114±3 108±9 35±4 37±6 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 116±2 115±3.6 35±5 35±2.8 135±12 149±3 240.3±2.5 245.3±2.5 25.0 115±7 118±6 33±3 32±5 163±20 136±15 240.7±5.9 245.0±2.6 50.0 123±34 123±5.3 34±4 33±3 147±8 162±14 243±7 246.3±6.0 100.0 106±7 120±4 33±4 35±2 146±8 144±6 241±1 244.0±1.7 micro-ZnO 5.0 120.7±24.0 107.0±2.6 29±3.5 28.7±5.3 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 102.3±3.5 106.7±1.5 32±8.2 30.3±2 135±12 149±3 240.3±2.5 245.3±2.5 25.0 103.0±2.0 102.7±3.2 28.7±3.8 30.6±6.1 163±20 136±15 240.7±5.9 245.0±2.6 50.0 101.7±4.7 111.0±4.0 30±2 32.3±6.7 147±8 162±14 243±7 246.3±6.0 100.0 101.0±3.6 114.7±4.6 30.3±2.08 32.3±6.7 184.7±2.1 183.7±1.5 241±1 244.0±1.7 NaN3 1 － － － － 1580.0±120. 0* － － －2-AF 2 － 1566.7±100.2* － 1306.7±120.6* － 1536±324* － －MMS 1 － － － － － － 802.7±3.8* －

4 讨论

纳米TiO2具有独特的光催化性、优异的颜色效应以及紫外线屏蔽等功能，其无毒、无刺激、耐水、无异味、稳定性好，作为紫外屏蔽剂主要应用于防晒化妆品中。纳米ZnO也是很好的光催化剂，在紫外光照射下，便能分解有机物质，抗菌和除臭，也同样被广泛用于化妆品，主要用来制造防晒剂[3]。纳米颗粒和纳米技术在化妆品行业的应用是一个具有潜力的发展方向，但其安全问题也令人担忧[5]。各国政府、科学界、企业界等纷纷发表关于人造纳米材料安全性的调研报告。美国国家自然基金会、美国环保局和美国安全生产和职业保护全国委员会已联合投入2200万美元，用于资助65个与“纳米科技与人体健康和环境影响”的研究项目。我国也已将纳米安全性列入“973”项目，对纳米安全性问题进行了积极部署，国家自然科学基金委已从2004年开始，对重大项目中的一些涉及了该领域研究的交叉学科提供了资助。

当物质达到纳米级后，会出现很多常规物质没有的特殊性质，如特异的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应等，其光学、热学、电学、磁学、力学、化学等性质也就相应地发生十分显著的变化。纳米物质在生物体中的生理行为与常规尺度的物质可能会有很大的不同，是否会导致特殊的有害效应？因此原有对常规尺度物质的安全评估体系是否适合于纳米材料是人们面临的一个重大问题。充分揭示纳米物质的特性与毒作用的关系，通过与常规尺度的比较揭示其毒作用特征，无疑有助于这一问题的回答[6-7]。

常规尺度的ZnO毒性较低，而目前已有的研究资料显示纳米ZnO有较强的细胞毒性和体内毒性，提示纳米ZnO与常规尺度ZnO相比其毒性可能有明显差异，但纳米和超细的ZnO与TiO2毒性差异的研究资料相对较少。因此，本实验采用TA97、TA98、TA100和TA102标准菌株，从遗传致突变性方面来评价纳米和超细ZnO、纳米和超细TiO2颗粒的安全性。此次实验采用平皿掺入法对对5个级数剂量的纳米和超细ZnO颗粒、纳米和超细TiO2进行研究，结果显示纳米和超细ZnO颗粒、纳米和超细 TiO2颗粒在S9活化和非活化两种测试条件下，诱发TA97、TA98、TA100和TA102产生的回变菌落数与溶剂与阴性对照相比均无明显增加，这表明纳米和超细ZnO、纳米和超细TiO2在实验剂量范围内未显示致突变作用，不具有诱变性。Yoshida等[8]研究了纳米ZnO的致突变作用，其实验结果表明在有无S9的TA98、TA100、TA1535、TA1537菌种，微米ZnO和纳米ZnO都没有致突变作用，说明纳米ZnO在致突变作用方面与常规ZnO没有区别，这与本实验结果一致。然而，对于纳米或超微TiO2以及ZnO的安全性研究尚需结合动物骨髓细胞微核试验、小鼠精子实验以及其他体内、外实验结果进行综合判定。

5 结论

在本实验条件下，纳米和超细粒径的TiO2和ZnO颗粒在实验剂量范围内均未显示致突变性。

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［2］刘春光，罗青松. 纳米氧化锌的制备技术与应用进展[C]. 中国纳米技术应用研讨会论文集，2004.

［3］祖庸，雷闫盈，王训，等. 纳米ZnO的奇妙用途[J]. 化工新型材料，1999, 27(3)：14-16.

［4］Warheit D B, Sayes C M, Reed K L, et al. Health effects related to nano-particle exposures: environmental, health and safety considerations for assessing hazards and risks[J]. Pharmacol Ther,2008, 120(1): 35-42.

［5］印木泉. 遗传毒理学[M]. 北京：科学出版社，2002：489-491.

［6］陈卫民，王罡，陶学金，等. 纳米磷酸三钙复合人工骨的Ames致突变试验[J]. 临床口腔医学杂志，2005,21（12）：720.

［7］洪丽玲，丁树娟，朱江波，等. 纳米氧化锌与常规氧化锌对A549细胞的毒性与DNA损伤的比较研究[J]. 癌变 畸变 突变，2011, 23（5）：340-343.

［8］Yoshida R, Kitamura D, Maenosono S. Mutagenicity of water-soluble ZnO nanoparticles in Ames test[J]. J Toxicol Sci, 2009, 34: 119-122.