化学品快速生物降解性经典测试方法的要点比对

刘纯新，于丽娜，杨力，聂晶磊，陈琳，殷雅丹

中国环境科学研究院，环境保护部化学品登记中心，北京 100012

化学品快速生物降解性经典测试方法的要点比对

刘纯新，于丽娜，杨力*，聂晶磊，陈琳，殷雅丹

中国环境科学研究院，环境保护部化学品登记中心，北京 100012

通过分析六种经典快速生物降解性测试方法的试验原理、操作特点以及限制因素，指出最好根据受试物对活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值，选择试验方法、受试物浓度和接种物浓度。比对了各方法在受试物适用浓度范围、接种物来源和前处理、无机培养基的配制和预处理、质量控制等方面的要求，指出快速生物降解性测试严禁接种物在接种前接触受试物；接种微生物的来源可能对试验结果影响很大；各方法需要的接种物浓度不同，建议采用平板计数方法确定并调整细菌数；对接种物和培养基进行有效的预处理，可减少空白值。应注意防止滤膜过滤和离心过程产生的有机碳干扰DOC的分析。列举了测试过程中常见的问题，强调应根据降解曲线分析试验结果；尽快研发跨区域、多来源的标准接种物。

化学品；快速生物降解性；测试方法；操作要点；比对

化学品快速生物降解性是受试物(有机物)在限定时间内与接种微生物接触，表现出的生物降解能力[1]，是鉴别化学物质的环境危害性和持久性，进行分类和标签[2]，评价和控制环境风险[3]的基本指标。若通过标准方法得到的测试结果表明该受试物在环境中可被迅速地生物降解，则列为“易生物降解”类物质[1]。国际上普遍采用经济合作与发展组织(OECD)的六种经典快速生物降解性测试方法[4]，分别为：溶解性有机碳(DOC)消减试验(301A)，二氧化碳(CO2)产生试验(301B)，改进的MITI试验(I)(301C)，密闭瓶试验(301D)，改进的OECD筛选试验(301E)和呼吸计量法试验(301F)。欧盟在2008年实施的《关于化学品注册、评估、许可与限制(REACH)法规》和EC 4402008法规[5]将这六种经典方法写入技术法规(相当于我国的强制性国家标准)的C.4部分，要求进口到欧盟成员国的化学品提交这些测试数据。

我国国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会于2008年分别将OECD的六种经典方法等同转化为六项国家标准[8-13]，概述各方法技术要点的GBT 27850—2011《化学品 快速生物降解性 通则》于2012年8月1日实施[14]。OECD于2006年在“301B：二氧化碳(CO2)产生试验”基础上推出的新方法“310：密闭瓶二氧化碳(顶空试验)法”[15]，目前尚未转化为我国标准。

2011年12月1日实施的《危险化学品安全管理条例》[16]规定，环境保护主管部门负责组织化学品的环境危害性鉴定和环境风险程度评估。2011年10月《国务院关于加强环境保护重点工作的意见》(国发〔2011〕35号)要求把环境风险评估作为危险化学品项目评估的重要内容[17]。作为履行上述职责的基础，快速生物降解性数据的科学性、可靠性更加受到各方面的关注。但由于种种原因，目前一些测试机构出具的快速生物降解性测试数据质量不高，影响了鉴定和评估结果的科学性。

针对常见的问题，结合制订测试方法标准，对OECD的六种经典测试方法的技术要点进行比对研究。其中，仪器设备、试验用水、受试物前处理、取样等操作要点参见文献[18]。笔者重点讨论六种经典方法的受试物浓度范围、接种微生物的选择、培养基成分等操作要求和注意事项，以期引起同行的关注。

1 对受试物浓度范围的要求

六种经典测试方法由于原理和所用仪器设备的不同，对受试物浓度的限制因素多，要求也不同(表1)。

表1 六种快速生物降解性测试方法的受试物浓度

1)理论上受试物浓度为2～10 mgL，但对于大多数受试物，当浓度超过5 mgL时，瓶中溶解氧不能满足降解需要；2)对ThOD值低的物质。

301A和301E两种方法只能测试易溶于水、难挥发、不易吸附的物质。反应容器用铝箔封口，内外空气可以自由交换，通过在恒温振荡器上振荡维持试验溶液中的溶解氧[18]。受复氧速率和DOC分析精度等因素限制，反应容器中受试物的DOC浓度应控制在10～40 mgL[8,12,19]。

301B用脱CO2的空气曝气，复氧速率和溶解氧浓度可以得到保证。该方法用Ba(OH)2或NaOH溶液吸收生化反应产生的CO2，通过滴定剩余碱液或测定无机碳计算CO2的浓度，进而计算受试物的降解率。如果反应容器中有机碳浓度过低，将影响测试精度；如果有机碳浓度过高，将增加CO2吸收瓶的数量，以及Ba(OH)2或NaOH的用量。因此，该方法反应容器中受试物的有机碳浓度(DOC或总有机碳TOC，难溶物质以悬浮液计)应控制在10～20 mgL。对于难溶物质，试验过程中通过磁力搅拌保持悬浮状态[9]。

经典的301C采用专用的MITI测定仪，配备六个烧瓶在密闭条件下进行磁力搅拌，通过电解瓶电解CuSO4溶液产生的氧气补充消耗的溶解氧。该方法可测试难溶于水、易吸附及易挥发的化学物质；但对于易挥发性物质，应注意尽量减小试验烧瓶上部气体空间的体积；因采用电解法连续供氧系统，因此该方法基本不受溶解氧变化的限制。可选择较高的受试物浓度，一般地，受试物浓度设定为100 mgL(难溶物质以悬浮液计)[10]。

301D以BOD瓶作为反应容器，瓶中充满试验液体后密闭，无外界供氧。受瓶中液体溶解氧的总量限制，且为保证溶解氧测定精度，应始终保持DO浓度≥0.5 mgL，受试物浓度一般控制在2～5 mgL，对于不易降解或理论需氧量(ThOD)低的物质，可提高到5～10 mgL。对于缺乏毒性信息，且未预先测试活性污泥呼吸抑制作用[20-21]的受试物，为得到可靠的测试结果，最好选择2和5 mgL两个受试物浓度同时进行试验。只要其中一个浓度的试验在10 d观察期或14 d达到通过水平，即可认为该受试物具有快速生物降解性。对于含氮的受试物，需校正硝化作用的影响[11,18]。

301F与301C原理相似，都是受试物在密闭条件下进行磁力搅拌，用CO2吸收剂吸收产生的CO2。二者不同之处在于，301F根据所使用呼吸计的厂家、型号的不同，可测量电解产生的氧气量，也可测量容器内气体压力的变化；能连续测量并记录，也能定期、间歇测定。因此301F受试物浓度(难溶物质以悬浮液计)与301C相似，一般为100 mgL，但ThOD要保持在50～100 mgL[13]。如果使用无供氧装置的BOD测定仪(WTW Oxitop 110C或Lovibond ET99724A系列)作为呼吸计，要特别注意试验液体体积、预留顶空氧气的量，在保证溶解氧浓度的前提下，计算受试物浓度。对于含氮的受试物，计算ThOD时需校正硝化作用的影响。

2 各测试方法对接种物来源的要求

2.1 301A、301B和301F接种物的来源

301A、301B和301F方法原则上都可采用多种来源的接种微生物：活性污泥、污水处理厂出水、地表水、土壤，或以上几种的混合物。建议采用平板计数等方法，对采集的地表水进行菌落计数，确保接种后的试验培养基中细菌数为107～108个L[8-9,13,19]。

2.1.1 活性污泥接种物

选择以处理生活污水为主、正常运转的普通活性污泥法的城市污水处理厂或中试规模的处理设施，从曝气池中取新鲜的活性污泥样品[19]作为接种物。

2.1.2 其他来源的接种物

可选择以处理生活污水为主的污水处理厂或中试规模的处理设施，从二沉池中取未经灭菌处理的二级出水作为接种物。

也可采集河水、湖水等地表水样品作为接种物。若菌落计数达不到要求，可采用过滤或离心等方式进行浓缩。

由于不同来源的接种物中微生物种类存在差异，对于某些受试物，得出的快速生物降解性测试结果差异较大。鉴于处理生活污水的污水处理厂的活性污泥中微生物种类丰富，且采用活性污泥得出的测试结果更适用于评价该受试物排放后对水环境的影响，因此，301A、301B和301F首选活性污泥作为接种物。

2.2 301C接种物的来源

301C最大的特点是采用标准化的复合接种物。经典的301C由日本通产省[19]提出，采用日本化学物质测试中心提供的标准接种物。该标准接种物是每个季度在日本十个场所(两个内海、一个湖泊、一个化工废水处理厂以及分别位于日本南部、中部、北部的三个城市污水处理厂和三条河流)采集地表水、土壤和活性污泥，混合、培养而成[19,22-23]。该标准接种物中的微生物种类多，活性相对稳定，适应范围广，能够代表日本各区域的微生物特性，日本的测试机构大多采用301C和标准接种物测试化学品的快速生物降解性。我国相关单位相应开展了一些研究，但目前尚未推出标准的接种物；采用301C的实验室往往在所在城市选10个地点，采集微生物作为接种物。

2.3 301D接种物的来源

301D由于BOD瓶内外没有气体交换，受BOD瓶中液体溶解氧的总量限制，要求细菌数为104～106个L，只能接种采自生活污水处理厂未经灭菌处理的二级出水或地表水，首选二级出水[11]。如果加入细菌浓度过高的污水，或直接用活性污泥接种，由于内源呼吸耗氧量大，测试过程中空白对照组的溶解氧浓度下降超过1.5 mgL，或试验组瓶中溶解氧浓度低于0.5 mgL，会掩盖受试物的降解情况或影响受试物的降解反应，导致试验失败。

2.4 301E接种物的来源

301E要求选择以处理生活污水为主的污水处理厂或中试规模的处理设施，从二沉池中取未经灭菌处理的二级出水进行菌落计数，确保接种后的每L试验培养基中细菌的数量级为105[12]。

不同地区的城市污水处理厂，微生物相会存在差异。同一城市处于不同运行状态的污水处理厂，微生物相的差异也很大。若采用主要处理工业废水的污水处理厂的活性污泥作为接种物，得出的降解率可能会偏低。采集接种物之前，应详细调查备选污水处理厂运行是否稳定，及其所处理的生活污水、工业废水的成分和所占比例。

各测试方法接种微生物的来源和接种物浓度如表2所示。

表2 各测试方法接种微生物的来源和接种物浓度

1)SS为悬浮固体；2)以每个季度在日本10个场所收集的地表水、土壤和活性污泥，混合、培养1～3个月而成。

3 接种物前处理

所有快速生物降解性测试方法的接种物都不对受试物进行驯化。在正式试验的接种前，严格避免接种物与受试物接触[19]。

3.1 301A、301B和301F接种物的前处理

3.1.1 活性污泥接种物

从曝气池中取新鲜的活性污泥样品后，在运输和处理过程中应一直曝气，保持有氧状态。用细筛滤除粗糙颗粒后，沉淀或离心分离(一般以相当于104ms2或1 100g的转速，离心10 min)，将浮在表面的杂质除去。用试验培养基清洗(将活性污泥与试验培养基充分混合后，沉淀或离心分离，去掉悬浮物和上层液体；用过量的试验培养基悬浮洗过的活性污泥，再沉淀或离心；重复这一操作直到洗净、不含抑制细菌的物质为止)，使活性污泥在试验培养基中浓度为3～5 gL，曝气培养直至使用。

也可用匀浆器以中等速度将活性污泥搅拌2 min，使其分散均匀(SS浓度为3～5 gL)，沉淀30 min，用试验培养基清洗[8]。

为减少试验的空白值，提高试验精度，一般活性污泥应在试验温度下〔(22±2) ℃〕，在试验培养基(无受试物)中曝气培养5～7 d。试验前应从悬浮污泥中抽取一份样品，测定活性污泥的干重。

如果活性污泥不是取自普通活性污泥法的污水处理厂，而是取自其他工艺的高效污水处理厂，或估计含有抑制细菌的物质，应在去除悬浮物后，用试验培养基仔细清洗活性污泥，直到不含多余的有机物或抑制性物质[19]。

3.1.2 其他来源的接种物

如果采集未灭菌的二级出水，在运输中应保持有氧状态。样品沉淀1 h或用粗滤纸过滤后，保持上清液或滤出液在有氧状态直至使用。

如果采集地表水样品(如河水、湖水)，去除悬浮物和沉淀物后，保持有氧状态直至使用。

3.2 301B接种物的前处理

301B的接种物，除了按3.1节操作外，还应在试验开始前，在试验容器中加入接种物和培养基后，用脱CO2的空气长时间曝气，除去其中溶解的CO2后，再加入受试物或参比物。

3.3 301C接种物的前处理

我国目前尚无符合301C要求的标准接种物，不同测试机构往往自行选点采集活性污泥等作为接种物。因此，应按301C对接种物培养和前处理、试验温度〔(25±1) ℃〕、pH、营养成分、曝气间隔的具体要求操作[10,22-23]。

3.4 301D和301E接种物的前处理

301D和301E，采集污水处理厂未经灭菌处理的二级出水，并在运输中保持有氧状态。用粗滤纸过滤除去悬浮物后，滤出液在试验温度下曝气5～7 d。

4 各测试方法培养基的配制和处理的要求

4.1 培养基的配制

4.1.1 无机营养盐贮备液

先按配方要求配制无机营养盐贮备液，再通过稀释制备试验培养基。同一试验所用培养基应为同一批配制。试验前，先用分析纯试剂制备四种贮备液，包括：1)由磷酸钾盐和钠盐与NH4Cl配制的缓冲溶液(a)；2)CaCl2溶液；3)MgSO4溶液；4)FeCl3溶液。为便于保存FeCl3贮备液，可向每升贮备液加入0.4 g的EDTA，或加入1滴(0.05 mL)浓盐酸。如贮备液中出现沉淀则不能使用。

301A、301B、301D、301E和301F五种方法要求试验的pH维持为7.4±0.2，缓冲溶液(a)的pH为7.4，采用的钠盐为二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)。301C最适pH为7.0，缓冲溶液(a)的pH为7.2，采用的钠盐为十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)[19]；NH4Cl的配比也与另外五个方法不同。

4.1.2 试验培养基

在试验开始时，用贮备液和蒸馏水制备试验培养基。虽然301A、301B、301D、301E和301F的贮备液相同，但由于301D的接种微生物浓度低，试验培养基中N、P、K、Na等四种无机营养元素浓度只相当于301A、301B、301E和301F等四种方法的110。因此在配制301D的试验培养基时，要特别注意缓冲溶液(a)的添加量，即按每L试验培养基加入1 mL缓冲溶液(a)的比例配制[11]；而配制301A等四个方法的试验培养基时，相应的缓冲溶液(a)的量为10 mL。

301E中，要求按每L试验培养基加入污水处理厂二级出水的滤出液0.5 mL的比例接种，接种微生物少，接种带入的微量元素和生长因子少，因此该试验培养基需另外补充Mn、B、Mo、Zn等微量元素和酵母浸膏溶液[12]。

301C试验的最佳pH与其他方法不同，不但缓冲溶液的成分配比不同，而且要求在配制试验培养基时，按每L试验培养基分别加入四种贮备液各3 mL的比例操作[10]。

六种快速生物降解性测试方法试验培养基成分和浓度如表3所示。

表3 六种快速生物降解性测试方法试验培养基成分和浓度

1)301E方法每L培养基中加微量元素溶液和维生素溶液各1 mL。

4.2 试验培养基的前处理

正式试验前，有些方法需要进行前处理。301B要求用脱CO2的空气或人工配制的标准气(氧气与氮气体积比为20∶80)对试验培养基曝气[9]，驱除溶解的CO2(注意在试验过程中，如果用工业纯氧代替脱CO2的空气，或代替配制的标准气曝气，虽然可以简化操作，但由于在纯氧曝气条件下，培养基中溶解氧浓度会显著提高，微生物的代谢状态与在空气曝气条件下不同[24]，将影响测试结果的可比性)。

301D要求在试验温度〔(22±2)℃〕下对试验培养基高强度曝气20 min以上，使溶解氧饱和，然后静置20 h达到稳定状态后，测定溶解氧浓度[11]。用虹吸管移液和装瓶时应保持试验培养基处于溶解氧饱和且无气泡释放的状态。

5 判定试验有效的条件

如果这六种经典方法的试验结果在稳定期、10 d观察期或28 d试验结束时，各平行组间受试物去除量的最大差别小于20％；并且参比物在14 d的降解率达到通过水平，才能认为有效。只要上述任一条件未满足，试验应重做[14]。

严格地讲，不能仅凭受试物降解率数值低，就断定受试物在环境中不能被生物降解，而是需要通过测试其固有生物降解性[22,25-26]或模拟环境降解试验[27-30]来进一步确定其生物降解性。

5.1 301A和301E的有效性

301A和301E试验中，若含有受试物和参比物的毒性对照组在14 d内DOC的去除率小于35％，可认为受试物对细菌有抑制性。应适当降低受试物浓度(不能低于检出限，不能影响DOC测定的精确性)，重新试验。

对于301A，还可提高接种物浓度(SS浓度应小于30 mgL)，重新试验。

5.2 301B的有效性

试验开始时，试验容器中受试物悬浮液的无机碳(IC)浓度必须少于总碳(TC)浓度的5％；试验结束时，接种物空白组中，每L培养基产生的CO2总量通常不超过40 mg，如果超过70 mg，应认真检查接种物的内源呼吸情况、是否带入多余的有机物、反应容器的气密性、脱CO2曝气系统、试验操作的全过程以及全部数据。

如果含有受试物和参比物的毒性对照组在14 d内CO2的产生量少于ThCO2的25％，可认为受试物对细菌有抑制性。可适当降低受试物浓度和或提高接种物浓度(SS浓度应小于30 mgL)，重新试验。

5.3 301C和301F的有效性

如果反应容器中的pH低于6.0或高于8.5，并且受试物氧消耗量少于ThOD的60％，应适当降低受试物浓度，重新试验。

以苯胺为参比物的程序对照组在7和14 d后，用氧消耗量计算出的苯胺降解率应分别超过40％和65％。否则，应重新试验。

5.4 301D的有效性

28 d试验结束时，接种物空白组的溶解氧与试验开始时相比，损耗不应超过1.5 mgL。若超过该值，需要检查各容器、导管和试验瓶的清洗、培养基的配制和曝气、接种物的细菌数、试验操作是否带入还原性物质等。

在试验过程中，试验瓶中溶解氧的残余浓度始终应不低于0.5 mgL。如果溶解氧浓度过低，溶解氧测定精度降低，而且好氧微生物的活动将受到抑制，影响测试结果。

如果含有受试物和参比物的毒性对照组在14 d内生物降解耗氧量达不到ThOD的25％，可认为受试物对细菌有抑制性。应适当降低受试物浓度，重做试验。

6 常见问题及处理措施

6.1 概念和思路不清楚，试验方案设计不当

化学品快速生物降解性测试(特别是301C、301D、301F)与废水生化需氧量(BOD)测试有相似之处，但在测试目的、原理、周期、操作等方面差别很大。如果301C和301F使用自动BOD测定仪(如WTW OxiTop 110C、Lovibond ET99724A系列)作为呼吸测定仪，照搬测定BOD(2 d+5 d)的做法，加烯丙基硫脲(allylthiourea)抑制硝化作用[31-32]，且不核算受试物的ThOD、顶空氧气量，容易导致试验失败。应注意，每一种化学品的降解性测试都相当于一项研究课题，要根据受试物的物理、化学、毒理等方面的性质，对试验方案和操作及时进行调整。

6.2 缺少或不会运用毒性信息，受试物试验浓度设置不当

多数情况下，测试机构缺少或不知如何运用受试物对微生物的毒性信息。若受试物的试验浓度偏高，使细菌活性受到抑制，导致降解率偏低。该类受试物容易被误判为难生物降解物质。要避免该类问题，在测试快速生物降解性之前，最好测试该物质对活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值。将快速生物降解性测试的受试物浓度设置为EC50的110(或低于EC20)[20-21]。当EC50lt;20 mgL时，为避免影响后续试验，最好同时以2个较低的受试物浓度进行301D试验，并设置毒性对照组。

6.3 缺乏环境微生物方面的背景信息，接种微生物来源选择不当

若为方便，就近取地表水作为接种物，未判断其中微生物浓度和活性即进行试验，往往重现性不好，有时为阳性而有时为阴性。某些城市污水处理厂工业废水比例过高，活性污泥或二级出水中细菌种类较少；或者某些污水处理厂运行不稳定，细菌的活性不够，都会影响试验结果。对此，在选择接种物前，要周密调查备选污水处理厂的污水来源、主要工艺、运行状况等，最好选择运行稳定，主要处理生活污水、普通活性污泥法的污水处理厂的活性污泥或二级出水作接种物。

6.4 不熟悉测试方法的要领，接种物浓度控制不当

若不了解所选测试方法的原理、供氧方式和复氧速率，未控制接种物中细菌浓度，接种物浓度过高将使试验溶液中缺氧，达不到质控条件(301D尤其突出)。若接种物浓度过低，由于细菌种类、数量少，可能导致停滞期延长，降解率偏低。301A和301E未要求测溶解氧；实际操作中，靠烧瓶振荡复氧，对试验结果有效性的影响容易被忽视。要解决该类问题，掌握各方法、各步操作所涉及的背景知识是非常必要的；同时通过实际测定以控制接种物中的细菌浓度。

6.5 培养基前处理不当

实际测试中，配制试验培养基后，容易忽视前处理的一些细节。若301B中脱CO2的曝气系统气密性不好，或曝气不彻底，不能有效驱除培养基中溶解的CO2，空白值将偏高。要避免该类问题，应注意检查供气和培养基中是否残余CO2。

若301D曝气系统给试验培养基带入油滴等杂质，会使试验瓶中溶解氧消耗过快，甚至导致试验失败。要避免该类问题，应慎重选用空压机和曝气管，通过过滤等方式，确保供气的清洁。

6.6 取样预处理不当

对于301A和301E等用有机碳分析仪测定DOC的方法，如果取样后用0.45 μm滤膜过滤，一方面，滤膜表面涂层的亲水性物质可能进入滤出液；另一方面，有些受试物可能与过滤器、滤膜发生作用，引起偏差。要减少该类偏差，每次试验前，将过滤器、滤膜放入去离子水中煮沸三次，每次煮1 h，去除涂层物质和溶解性有机物。还可采取预饱和等措施，确保过滤器、滤膜不释放出溶解性有机碳、不吸附受试物。

6.7 结果判断不当

试验结束，在判断受试物是否具有快速生物降解性时，往往关注28 d的降解率，而忽视降解曲线；甚至在试验前未考虑为绘制降解曲线预留足够的取样点(如每7 d取一次样，对于很多受试物无法绘制出完整的降解曲线，得不出降解趋势)。要解决该类问题，在设计试验方案、分析试验结果、判断受试物的降解性时，应考虑整个降解曲线，明确其停滞期、对数增长期和平稳期。快速生物降解性的六种经典方法规定试验周期为28 d，以使接种微生物有足够的时间去适应受试物，避免因周期短而错过对一些受试物降解情况的观察，同时确保得到完整的降解曲线。当降解率达到10％(或CO2的产生量达到ThCO2的10％)，表明生物降解已经开始，只有在随后的10 d内(301C除外，如果采用14 d观察期，以试验的第14天计)达到通过水平才表明其具有快速生物降解性。如果受试物在经过较短的停滞期后缓慢降解，未在10 d观察期内达到通过水平，则不认为其具有快速生物降解性。

7 结论和建议

(1)根据各方法的原理、设备、供氧、操作特点，确定最佳的试验方案和受试物浓度。

(2)化学品对微生物的毒性和抑制作用，会导致试验结果的误判。对于缺少该类信息的受试物，最好先测定其对活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值，再选择试验方法和接种物浓度。

(3)接种微生物的来源对试验结果影响很大。301A、301B、301F三种方法最好选择运行良好、主要处理生活污水、普通活性污泥法的污水处理厂或中试装置的活性污泥；301D和301E两种方法最好选择运行良好的生活污水处理厂的二级出水；301C采用多来源、混合培养的微生物作为接种物。为提高试验的可比性和复现性，我国应尽快研究推出标准接种物。

(4)所有快速生物降解性测试的接种物都不对受试物进行驯化，严格避免接种物在接种前与受试物接触。在试验前，对接种物和培养基进行前处理，充分减少空白值。

(5)接种物浓度过高、过低，都会影响试验结果。各方法需要的接种物浓度不同，最好采用平板计数等方法确定细菌数，并调整接种微生物浓度。

(6)对于301A和301E等需要测定DOC浓度的方法，取样后的预处理，不论采用滤膜过滤还是高速离心，都要注意防止溶出的有机碳对DOC浓度分析的干扰。

(7)应重视降解曲线，在设计试验方案时预留足够的取样点。在分析试验结果、判断受试物的降解性时，应考虑其整个降解曲线，明确其停滞期、对数增长期和平稳期。

[1]国家环境保护总局.化学品测试方法[M].北京:中国环境科学出版社,2004.

[2]United Nations.Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals(GHS)[M].3rd ed.New York:United Nations Publication,2009:215-240.

[3]van LEEUWEN C J,VERMERIRE T G.Risk assessment of chemicals an introduction[M].2nd ed.Dordrecht:Springer,2007: 73-409.

[4]Organization for Economic Co-operation and Development.OECDguideline for testing of chemicals[M].Paris:OECD Publications,1993.

[5]The Commission of The European Communities.Council Regulation (EC) No.4402008[EBOL].(2008-05-30)[2012-05-18].http:eur-lex.europa.euLexUriServLexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:142:0001:0739:en:PDF.

[7]环境保护部.新化学物质申报登记指南[EBOL].(2010-09-16)[2012-05-18].http:www.mep.gov.cnpv_obj_cachepv_obj_id_A307C2706731EC4386428C731D210489261E0900filenameW020100921500388885939.pdf.

[8]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21803—2008 化学品 快速生物降解性 DOC消减试验[S].北京:中国标准出版社,2008.

[9]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21856—2008 化学品 快速生物降解性 二氧化碳产生试验[S].北京:中国标准出版社,2008.

[10]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21802—2008 化学品 快速生物降解性 改进的MITI试验(Ⅰ)[S].北京:中国标准出版社,2008.

[11]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21831—2008 化学品 快速生物降解性 密闭瓶法试验[S].北京:中国标准出版社,2008.

[12]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21857—2008 化学品 快速生物降解性 改进的OECD筛选试验[S].北京:中国标准出版社,2008.

[13]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21801—2008 化学品 快速生物降解性 呼吸计量法试验[S].北京:中国标准出版社,2008.

[14]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 27850—2011 化学品 快速生物降解性 通则[S].北京:中国标准出版社,2012.

[15]Organization of Economic Cooperation and Development.Test No.310:ready biodegradability:CO2in sealed vessels(headspace test)[EBOL].(2006-03-23)[2012-05-18].http:titania.sourceoecd.orgvl=8728439cl=14nw=1rpsvcgi-binfulltextew.pl?prpsv=ijoecdjournals1607310xv1n3s13p1. idx.

[16]中华人民共和国国务院.危险化学品安全管理条例[EBOL].(2011-03-02)[2012-05-18].http:www.gov.cnflfg2011-0311content_1822902.htm.

[17]中华人民共和国国务院.国务院关于加强环境保护重点工作的意见(国发〔2011〕35号)[EBOL].(2011-10-17)[2012-05-18].http:www.gov.cnzwgk2011-1020content_1974306. htm.

[18]刘纯新,沈英娃,黄星,等.化学品快速生物降解性六种经典测试方法的技术要点比对[J].环境工程技术学报,2012,2(1):1-6.

[19]OECD.Test No.301:ready biodegradability[EBOL].(1992-07-17)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-301-ready-biodegradability_9789264070349-en;jsessionid=1816fjr8gttv3.delta.

[20]OECD.Test No.209:activated sludge,respiration inhibition test[EBOL].(2010-07-23)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-209-activated-sludge-respiration-inhibition-test_9789264070080-en.

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[22]OECD.Test No.302C:inherent biodegradability:modified MITI test(Ⅱ)[EBOL].(1981-05-12)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-302c-inherent-biodegradability- modified-miti-test-ii_9789264070400-en.

[23]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21818—2008 化学品 固有生物降解性 改进的MITI试验(Ⅱ)[S].北京:中国标准出版社，2008.

[24]顾夏声,黄铭荣,王占生,等.水处理工程[M].北京:清华大学出版社,1985:202.

[25]OECD.Test No.302A:inherent biodegradability:modified SCAS test[EBOL].(1981-05-12)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-302a-inherent-biodegradability-modified-scas-test_9789264070363-en.

[26]OECD.Test No.302B:inherent biodegradability:Zahn-WellensEMPA test[EBOL].(1992-7-17)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-302b-inherent-biodegradability- zahn-wellens-evpa-test_9789264070387-en.

[27]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21795—2008 化学品 模拟试验 污水好氧处理 生物膜法[S].北京:中国标准出版社,2008.

[28]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.GBT 21829—2008 化学品 污水好氧处理模拟试验 活性污泥单元法[S].北京:中国标准出版社,2008.

[29]OECD.Test No.307:aerobic and anaerobic transformation in soil[EBOL].(2002-04-24)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary. orgenvironmenttest-no-307-aerobic-and-anaerobic-transformation-in-soil_9789264070509-en.

[30]OECD.Test No.308:aerobic and anaerobic transformation in aquatic sediment systems[EBOL].(2002-04-24)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-308- aerobic-and-anaerobic-transformation-in-aquatic-sediment-systems_ 9789264070523-en.

[31]环境保护部.HJ 505—2009 水质 五日生化需氧量(BOD5)的测定 稀释与接种法[S].北京:中国环境科学出版社,2009：12.

[32]International Organization for Standardization.ISO 5815-1:2003 Water quality-determination of Ⅱ biochemical oxygen demand after n days (BODn):Part 1.Dilution and seeding method with allylthiourea addition[SOL].Switzerland:International Organization for Standardization,2003.(2003-04-01)[2012-05-18].http:www.iso.orgisoiso_cataloguecatalogue_tccatalogue_detail.htm?csnumber=31090. ○

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ComparisonsofClassicalTestMethodsofReadyBiodegradabilityforChemicals

LIU Chun-xin, YU Li-na, YANG Li, NIE Jing-lei, CHEN Lin, YIN Ya-dan

Chemical Registration Center of Ministry of Environmental Protection, Chinese Research Academy of Environmental Science, Beijing 100012, China

By analyzing the experimental principle, operating feature and limited factors of six classical test methods of ready biodegradability, it was pointed out that the suited test method, test substance concentration and inoculum concentration had better be selected according to the values ofEC50andEC20of activated sludge from respiration inhibition test. After comparing the requirement on concentration ranges of test substances, source and pre-condition of inoculum, preparation and preliminary treatment of mineral medium, and validity of quality control of the six test methods, it was indicated that inoculum was forbidden to contact test substances before inoculating in all test methods of chemicals for ready biodegradability; different sources of inoculum might impact on test results greatly. Each method required different concentrations of inoculum, and it was suggested that bacteria should be enumerated by using plate-counting techniques and microbial cell densities controlled accordingly. The effective preliminary treatment of inoculum and mineral medium could reduce blank values. It was important to avoid organic carbon generated from filter membrane or centrifugation influence on analyzing DOC concentration. Frequent questions in test process were listed, and it was emphasized that test results should be estimated from degradation curve, and that trans-areas and multi-source standard inoculum should be researched and developed as soon as possible.

chemicals; ready biodegradability; test methods; operation key points; comparison

1674-991X(2013)02-0124-09

2012-06-11

国家标准制修订计划项目(20081305-T-469)；国家环境保护标准制修订项目(2011-26)

刘纯新(1974—)，男，副研究员，硕士，主要从事化学品污染防治和生态毒理学测试、GLP体系研究，liucx@crc-mep.org.cn

*通讯作者:杨力(1973—)，女，高级工程师，主要从事化学品环境管理研究，yangl@crc-mep.org.cn

X592 X831

A

10.3969j.issn.1674-991X.2013.02.021